血清和關(guān)節(jié)液中YKL對骨性關(guān)節(jié)炎

關(guān)于血清和關(guān)節(jié)液中YKL對骨性關(guān)節(jié)炎一、課題簡介關(guān)節(jié)軟骨特性：光滑、耐磨、富有彈性及一些特有的機械性能功能：傳導(dǎo)載荷、吸收震蕩、潤滑關(guān)節(jié)

第2頁,共50頁，星期六，2024年，5月

由于關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)，一旦損傷，很難自我修復(fù)(oncedestoryed，isnotrepaired)第3頁,共50頁，星期六，2024年，5月Alginate實驗流程圖第4頁,共50頁，星期六，2024年，5月謝謝！第5頁,共50頁，星期六，2024年，5月前言關(guān)節(jié)軟骨是一種高度分化的組織，由于缺乏血供，損傷后很難自我修復(fù)（oncedestoryed，isnotrepaired）

第6頁,共50頁，星期六，2024年，5月AutologousChondrocyteTransplantation（ACT）1994年，Brittberg第7頁,共50頁，星期六，2024年，5月謝謝第8頁,共50頁，星期六，2024年，5月國內(nèi)外曾用多種修復(fù)方法來治療軟骨損傷，如刨削成形術(shù)、微骨折術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)等，其基本原理是利用生物或機械因素使骨髓中的多能干細胞到達軟骨缺損區(qū)，并進一步分化為軟骨及骨組織。研究發(fā)現(xiàn)形成的軟骨為纖維軟骨或類透明軟骨，且該軟骨容易發(fā)生退變。第9頁,共50頁，星期六，2024年，5月謝謝第10頁,共50頁，星期六，2024年，5月本研究所屬領(lǐng)域范圍及性質(zhì)骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)生物學(xué)標(biāo)志物(Biomarkers,BiologicalMarkers<Mesh>,marker.BM)的研究領(lǐng)域。采用橫斷面研究的方法,對OA體液中生物學(xué)標(biāo)志物之一—YKL-40(又稱人軟骨糖蛋白-39,humancartilageglycoprtein-39,HCgp-39/GP-39)進行的臨床診斷性試驗研究。第11頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA概況(1)OA是引起關(guān)節(jié)疼痛和活動受限的常見病變,是世界性的關(guān)節(jié)疾病。在美國50歲以上的人群中已成為勞動力喪失的第二大疾患。在我國OA的發(fā)病率:農(nóng)村為9.6%,城市人群為4.9%。第12頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA概況(2)OA是以疼痛、腫脹、活動受限、彈響，有時伴關(guān)節(jié)積液，以及不同程度的局部炎癥,但無全身癥狀為特點的關(guān)節(jié)病。OA的病理生理學(xué)特點：負(fù)重部位的不規(guī)則軟骨喪失；軟骨下骨硬化、囊性變、邊緣骨贅形成不同程度的滑膜炎癥。第13頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA診斷的現(xiàn)狀目前臨床所通用的是1986年美國風(fēng)濕病協(xié)會關(guān)于OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要是以癥狀+X線征像為依據(jù)的?，F(xiàn)有檢查手段對OA軟骨退變診斷的局限性

MRIX線其征象改變比軟骨發(fā)生退變遲3-5年。第14頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA的生物學(xué)標(biāo)志物(BM)(1)

----概況近年來國內(nèi)外學(xué)者欲在OA患者的體液中尋找理想的病變標(biāo)志物，來及時反映關(guān)節(jié)軟骨代謝狀態(tài)和局部病變的進展情況，揭示病情活動或預(yù)后，并為臨床提供療效評價的客觀依據(jù)。美國國立衛(wèi)生研究院2000年建議用Biomarker取代marker,這樣可更好地揭示其生物學(xué)本質(zhì)。第15頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA的生物學(xué)標(biāo)志物(BM)(2)

----研究現(xiàn)狀大量實驗研究已發(fā)現(xiàn)許多能反映OA病情的BM：反映骨代謝的BM；反映軟骨代謝的BM；反映滑膜代謝的BM。

YKL-40：可能是反映軟骨和滑膜代謝的BM之一。近年來，國外開始進行臨床試驗研究。第16頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（2）

——研究現(xiàn)狀（1）反映骨代謝的BM

合成代謝I型膠原：I型前膠原氨基端前肽,I型前膠原羧基端前肽。非膠原蛋白：骨特異性堿性磷酸酶;骨鈣素。分解代謝I型膠原：脫氧吡啶酚,吡啶酚;I型膠原氨基端端肽,I型膠原羧基端端肽-1,2。非膠原蛋白：血漿酒石酸鹽耐受性酸性磷酸酶,骨唾液蛋白。第17頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（2）

——研究現(xiàn)狀（2）反映軟骨代謝的BM合成代謝Ⅱ型膠原：Ⅱ型前膠原羧基端前肽,ⅡA型前膠原氨基端前肽?？删鄣鞍锥嗵牵毫蛩彳浌撬乇砦?46,3B3,7D4。其它蛋白：YKL-40即人軟骨糖蛋白-39分解代謝Ⅱ型膠原：吡啶酚;Ⅱ型膠原新表位COL2-3/4m,COL2-1/4N1;Ⅱ型膠原羧基端端肽?？删鄣鞍锥嗵牵嚎删鄣鞍锥嗵瞧瑪?硫酸角質(zhì)素表位5D4,AN9P1;其它蛋白：軟骨寡聚基質(zhì)蛋白。第18頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（2）

——研究現(xiàn)狀（3）反映滑膜代謝的BM合成代謝I型和III型膠原：I型前膠原羧基端前肽,III型前膠原氨基端前肽。非膠原蛋白：透明質(zhì)酸;YKL-40;軟骨寡聚基質(zhì)蛋白;基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子。分解代謝I型和III型膠原：葡萄糖-半乳糖-吡啶酚;I型膠原羧基端端肽-2。第19頁,共50頁，星期六，2024年，5月YKL-40概況YKL-40（又稱人軟骨糖蛋白-39，humancartilageglycoprtein39，HCgp-39/GP-39）在非泌乳期牛的乳清分泌物中被首次發(fā)現(xiàn)的。來源：軟骨細胞、滑膜細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞等。相對分子量為40000的糖蛋白，含383個氨基酸。由10個外顯子構(gòu)成的含開放讀碼框架完全互補cDNA序列編譯。是殼質(zhì)酶(chitinase)糖蛋白家族的成員,但不具備殼質(zhì)酶活性。第20頁,共50頁，星期六，2024年，5月YKL-40的研究現(xiàn)狀（1）目前YKL-40的相關(guān)研究主要集中于以下領(lǐng)域：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；骨性關(guān)節(jié)炎；巨細胞性動脈炎；肝纖維化；乳腺癌和結(jié)腸直腸癌，等等。雖然YKL-40的作用機制尚不清楚，但研究表明它與許多組織的重塑和細胞外基質(zhì)降解有關(guān)。第21頁,共50頁，星期六，2024年，5月YKL-40的研究現(xiàn)狀（2）關(guān)節(jié)液內(nèi)YKL-40是軟骨細胞和滑膜細胞的分泌產(chǎn)物。OA患者[Volck]

：YKL-40在關(guān)節(jié)液中含量增加；血清水平也升高。Johansen報道：血清和關(guān)節(jié)液中YKL-40水平是反映滑膜炎時滑膜合成代謝水平的指標(biāo)。Volk等的研究表明：YKL-40可能在OA的關(guān)節(jié)軟骨降解和重塑形中也起著重要作用。第22頁,共50頁，星期六，2024年，5月YKL-40的研究現(xiàn)狀（3）YKL-40是一個反映滑膜和關(guān)節(jié)軟骨代謝的BM?經(jīng)檢索十年的CBMDisc未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)關(guān)于YKL-40在骨性關(guān)節(jié)炎方面的研究論文發(fā)表。第23頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（3）

——血清BM研究中的混雜因素血清BM除反映關(guān)節(jié)的病情外，還可能受其它因素的影響：生物節(jié)律的影響腸蠕動的影響體育活動的影響肝腎等疾病的影響年齡和性別的影響手術(shù)的影響藥物因素的影響第24頁,共50頁，星期六，2024年，5月OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（4）

--現(xiàn)有臨床診斷性研究論著的局限性

多以O(shè)A患者X線征象的Kellgren&Lawrence分級作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，來對照評價OA病情嚴(yán)重程度。充分考慮混雜因素控制的相關(guān)論著也不多見。第25頁,共50頁，星期六，2024年，5月本研究目的明確關(guān)節(jié)液（synovialfluid,SF）中YKL-40水平對膝OA的診斷價值；探討血清（Serum）中YKL-40水平對膝OA的診斷價值。第26頁,共50頁，星期六，2024年，5月本研究的特點診斷試驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎病理變化程度的評分；WOMAC骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)（由患者自我評估）；X線的Kellgren&Lawrence分級，負(fù)重位X線的膝關(guān)節(jié)間隙寬度。充分控制混雜因素探討血清YKL-40診斷價值。第27頁,共50頁，星期六，2024年，5月本研究的意義學(xué)術(shù)意義可以明確YKL-40對OA的診斷價值；可為OA的癥狀解釋、早期診斷及其分期提供一種實驗室檢查手段；可為OA的治療提供一種療效評價的客觀指標(biāo)；可為進一步研究確定國人體液YKL-40的正常參考值奠定基礎(chǔ)。經(jīng)濟效益近期效益；遠期效益。第28頁,共50頁，星期六，2024年，5月統(tǒng)計學(xué)分析X線評價體液YKL-40的檢測（ELISA）體液標(biāo)本的預(yù)處理和儲存OA病變程度的評價術(shù)中關(guān)節(jié)鏡下觀察采集關(guān)節(jié)液標(biāo)本采集血液標(biāo)本膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時術(shù)前化驗時病例選擇關(guān)節(jié)軟骨退變和滑膜炎關(guān)節(jié)鏡分級關(guān)節(jié)液和血清YKL-40濃度Kellgren&Lawrence分級技術(shù)路線功能評估WOMAC指數(shù)專業(yè)結(jié)論第29頁,共50頁，星期六，2024年，5月技術(shù)關(guān)鍵體液標(biāo)本的采集和預(yù)處理體液標(biāo)本的檢測統(tǒng)計學(xué)的統(tǒng)計處理第30頁,共50頁，星期六，2024年，5月研究方法（1）

——病例選擇病例來源：山醫(yī)二院骨科行膝關(guān)節(jié)鏡檢查和膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者。擇入標(biāo)準(zhǔn):非發(fā)育期患者（年齡＞18歲）；排除肝腎疾病、全身感染和癌癥等的患者；體液標(biāo)本采集前兩月未使用糖皮質(zhì)激素類藥物的患者。樣本含量：≥60例。第31頁,共50頁，星期六，2024年，5月研究方法（2）

——體液標(biāo)本的采集、預(yù)處理、儲存和檢測體液標(biāo)本的采集、儲存前處理、儲存和取用、以及檢測前處理和檢測，應(yīng)依據(jù)課題技術(shù)規(guī)范進行。本課題相關(guān)技術(shù)規(guī)范主要參考《PooleR.NIHWhitePaper:Biomakers,theOsteoarthritisInitiative(ABasisforDiscussion).Ferbruary3rd,2000.》制定。第32頁,共50頁，星期六，2024年，5月技術(shù)規(guī)范（1）

——體液標(biāo)本的采集體液標(biāo)本的采集規(guī)范血液標(biāo)本在清晨6-8時空腹抽取靜脈血5ml，留存于無菌非抗凝試管中送檢。并應(yīng)限制病人在采集標(biāo)本前活動。關(guān)節(jié)液標(biāo)本在行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時麻醉后采集：抽取關(guān)節(jié)液原液留存于無菌非抗凝試管中（盡量多抽取）。第33頁,共50頁，星期六，2024年，5月技術(shù)規(guī)范（2）

——體液標(biāo)本的儲存前處理

體液標(biāo)本均應(yīng)在采樣后2小時內(nèi)進行離心處理：血清標(biāo)本：在至少×600g，3000rpm，10分鐘的條件下離心。關(guān)節(jié)液標(biāo)本：在×2500g，4℃，15分鐘的條件下離心。（4500rpm，20min）第34頁,共50頁，星期六，2024年，5月技術(shù)規(guī)范（3）

—體液標(biāo)本的儲存和取用體液標(biāo)本的儲存標(biāo)本離心后取上清液，經(jīng)快速冷凍后,-70℃條件下凍存。體液標(biāo)本的取用在室溫下復(fù)溫解凍。標(biāo)本避免反復(fù)凍融。第35頁,共50頁，星期六，2024年，5月技術(shù)規(guī)范（4）

——體液標(biāo)本檢測前處理和檢測體液標(biāo)本的檢測前處理關(guān)節(jié)液標(biāo)本應(yīng)先經(jīng)離心后，取上清液測定其含量；血清標(biāo)本不需進行特殊處理。體液標(biāo)本的檢測ELISA法。第36頁,共50頁，星期六，2024年，5月研究方法（3）

——其它相關(guān)資料的收集臨床資料一般資料；臨床癥狀、體征；問卷調(diào)查：WOMAC指數(shù)實驗室檢查資料常規(guī)項目，血清Ⅳ型膠原。X線資料關(guān)節(jié)間隙的寬度；Kellgren&Lawrence分級。手術(shù)資料關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎程度的評分；手術(shù)錄像資料。第37頁,共50頁，星期六，2024年，5月技術(shù)規(guī)范（5）

——手術(shù)資料收集的注意事項手術(shù)中對關(guān)節(jié)內(nèi)組織的病變程度進行評價：關(guān)節(jié)軟骨損傷：Outerbridge膝關(guān)節(jié)軟骨損傷評分法；滑膜炎：Ayral膝滑膜炎評分法。術(shù)中對病變部位用探鉤進行相對測量，并注意留存錄像資料。第38頁,共50頁，星期六，2024年，5月研究方法（4）

—OA病變程度的對照評價標(biāo)準(zhǔn)關(guān)節(jié)組織的關(guān)節(jié)鏡征象評價標(biāo)準(zhǔn)關(guān)節(jié)軟骨退變程度：Outerbridge法；滑膜炎程度：Ayral膝滑膜炎評分法。OA病變程度的X線征象評價標(biāo)準(zhǔn)Kellgren&Lawrence分級；負(fù)重位的膝關(guān)節(jié)間隙寬度。OA病變程度的患者自我評估標(biāo)準(zhǔn)WOMAC骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)。第39頁,共50頁，星期六，2024年，5月研究方法（5）

—統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析OA組和非OA組之間體液YKL-40水平的比較用多元協(xié)方差分析。體液YKL-40水平與關(guān)節(jié)鏡下相關(guān)組織的病變程度評分之間用多元線性回歸。體液YKL-40水平與膝關(guān)節(jié)間隙寬度或WOMAC評分間用相關(guān)分析。第40頁,共50頁，星期六，2024年，5月可能遇到的問題及解決辦法標(biāo)本的采集、預(yù)處理和檢測等的標(biāo)準(zhǔn)化嚴(yán)格依據(jù)課題技術(shù)規(guī)范進行，才能保證結(jié)果的有效性和可比性?；祀s因素的控制探討血清YKL-40水平對OA診斷價值的關(guān)鍵。第41頁,共50頁，星期六，2024年，5月混雜因素的控制（1）生物節(jié)律影響的控制血液標(biāo)本的采集在固定時間（清晨6-8時）進行。腸蠕動影響的控制血液標(biāo)本在清晨空腹時采集。體育活動影響的控制采集血液標(biāo)本前限制病人的體育活動。第42頁,共50頁，星期六，2024年，5月混雜因素的控制（2）肝腎等疾病影響的控制選擇肝腎功能均正常的病例；若樣本含量不足時，用統(tǒng)計學(xué)方法進行控制。經(jīng)術(shù)前檢查可排除全身感染和腫瘤等的影響。年齡和性別影響的控制采用統(tǒng)計學(xué)方法進行控制。第43頁,共50頁，星期六，2024年，5月混雜因素的控制（3）手術(shù)影響的控制由于體液標(biāo)本是在麻醉后手術(shù)前采集的，故麻醉的影響可忽略。藥物因素影響的控制采集標(biāo)本前兩月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素類藥物。第44頁,共50頁，星期六，2024年，5月進度安排

2005年1月~2005年4月文獻檢索，課題設(shè)計，課題技術(shù)規(guī)范的制定,開題報告。2005年5月~2005年9月標(biāo)本的采集和預(yù)處理，臨床和手術(shù)資料的收集。2005年10月~2005年12月預(yù)實驗，部分體液標(biāo)本YKL-40含量的測定，分析關(guān)節(jié)液和血清YKL-40水平與膝骨性關(guān)節(jié)炎WOMAC評分和X線分級的相關(guān)性。2006年1月~2006年2月體液標(biāo)本YKL-40含量的測定，分析關(guān)節(jié)液和血清YKL-40水平與膝關(guān)節(jié)鏡下相關(guān)組織大體病理變化程度的相關(guān)性。2006年3月~2006年6月數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計分析，撰寫論文,論文答辯。第45頁,共50頁，星期六，2024年，5月開題條件（1）

——學(xué)術(shù)及技術(shù)條件研究人員衛(wèi)小春教授長期從事關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究,具有豐富的臨床經(jīng)驗和很強的科研能力.能及時把握國際上關(guān)節(jié)軟骨損傷研究的最新進展。主持承擔(dān)國家863計劃一項及省部級科研項目多項，在國內(nèi)外期刊上發(fā)表論文多篇。文獻和技術(shù)準(zhǔn)備已檢索并熟讀了大部分相關(guān)核心文獻，了解該領(lǐng)域的研究進展、YKL-40的檢測方法。病源及標(biāo)本來源山醫(yī)二院骨科病源充足；課題所需的體液標(biāo)本較易獲得。第46頁,共50頁，星期六，2024年，5月開題條件（2）

——實驗設(shè)備條件山醫(yī)二院所具備的實驗條件手術(shù)室：關(guān)節(jié)鏡設(shè)備；骨科實驗室：酶標(biāo)儀及相關(guān)波長的濾光片、深低溫冰箱、低速離心機、高速離心機、電熱恒溫孵育箱、電子天平、普通冰箱；放射科：拍片相關(guān)設(shè)備。第47頁,共50頁，星期六，2024年，5月開題條件（3）

——經(jīng)費預(yù)算

科研業(yè)務(wù)費3000元實驗材料費7000元儀器設(shè)備費4000元協(xié)作費1500元科研組織費2000元合計17500元

第48頁,共50頁，星期六，2024年，5月參考文獻PooleR.NIHWhitePaper:Biomakers,theOsteoarthritisInitiative(ABasisforDiscussion).Ferbruary3rd,2000.MorganteM,MetelliMR,MorganteD.ObservationsontheincreasedserumlevelsofYKL-40inpatientswithrheumatoidarthritisandosteoarthritis.MinervaMed.2001;92(3):151-3.JohansenJS,OleeT,PricePA,etal.RegulationofYKL-40productionbyhumanarticularchondrocytes.ArthritisRheu