個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測微陣列基因芯片關(guān)鍵技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范

個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測微陣列基因芯片技術(shù)規(guī)范

序言微陣列基因芯片是基于DNA分子雜交技術(shù)原理研制，經(jīng)過探針結(jié)合堿基互補(bǔ)序列單鏈核酸，從而確定其對應(yīng)序列來識別基因或其產(chǎn)物。能夠同時(shí)快速檢測多個(gè)基因及其多個(gè)位點(diǎn)，在多態(tài)性分析、突變分析、基因表示譜測定及雜交測序等多領(lǐng)域含有廣泛應(yīng)用價(jià)值。臨床診療技術(shù)使用微陣列基因芯片，可快速判定病原體、檢測遺傳突變及基因表示，更早更方便檢測腫瘤基因標(biāo)志，檢測藥品反應(yīng)和代謝相關(guān)基因多態(tài)性來指導(dǎo)臨床個(gè)體化診療。本規(guī)范意在對個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測中采取微陣列基因芯片檢測核酸序列和基因表示進(jìn)行通常性技術(shù)指導(dǎo)，不包含行政審批要求。本規(guī)范由全國生物芯片標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAC/TC421）提出。本規(guī)范起草單位：全國生物芯片標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、生物芯片北京國家工程研究中心、北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所。本規(guī)范起草人：項(xiàng)光新、李元源、王輝、鄧濤、孫義民、張治位、張川、邢婉麗、程京。

目錄1.適用范圍 12.申明/警告 13.術(shù)語和定義 14.樣本處理 24.1樣本類型 24.2樣本采集、運(yùn)輸和保留 34.3樣本質(zhì)量確保 34.4樣本信息保留 35.檢測各步驟分述 45.1核酸分離 45.2核酸定量（如適用） 45.3核酸擴(kuò)增和標(biāo)識 45.4芯片雜交 55.5信號采集和數(shù)據(jù)分析 56.結(jié)果匯報(bào) 57.質(zhì)量控制 58.注意事項(xiàng) 69.參考文件 71.適用范圍本規(guī)范適適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展微陣列基因芯片個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測服務(wù)。檢測服務(wù)需遵照國家衛(wèi)生主管部門或各專業(yè)協(xié)會公布疾病診療指南或國家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)政醫(yī)管局個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)教授委員會公布個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測指南。2.申明/警告本規(guī)范所稱微陣列基因芯片診療技術(shù)是指從醫(yī)療機(jī)構(gòu)取得臨床樣本中，提取核酸（DNA或RNA），進(jìn)行必需擴(kuò)增和標(biāo)識，標(biāo)識后靶標(biāo)和基因芯片進(jìn)行分子雜交，經(jīng)過基因芯片掃描儀器取得基因芯片雜交圖像和數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)程序分析，并給出檢測匯報(bào)全過程。3.術(shù)語和定義（1）聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction（PCR）聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)是一個(gè)對特定DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增方法。（2）雜交hybridization含有一定同源序列兩條核酸單鏈（DNA或RNA）能夠經(jīng)過氫鍵方法，按堿基互補(bǔ)配對標(biāo)準(zhǔn)相結(jié)合。（3）突變mutation是細(xì)胞中DNA核苷酸序列發(fā)生了穩(wěn)定可遺傳改變。（4）點(diǎn)反復(fù)spotreplicates每種探針在芯片上每個(gè)陣列中反復(fù)次數(shù)。（5）探針probe能夠和靶標(biāo)特異性結(jié)合分子，多數(shù)情況下探針固定在基片上。（6）質(zhì)控探針qualitycontrolprobe用來監(jiān)控芯片表面化學(xué)修飾、樣品制備和反應(yīng)過程等步驟質(zhì)量探針。該探針只和反應(yīng)體系中外加帶有可檢測標(biāo)識物靶標(biāo)發(fā)生特異性結(jié)合，故可用于監(jiān)控探針和基片結(jié)合質(zhì)量及探針和靶標(biāo)結(jié)合質(zhì)量等整個(gè)反應(yīng)過程質(zhì)量。（7）表面化學(xué)修飾質(zhì)控探針surfacemodificationcontrolprobe微陣列基因芯片上用來質(zhì)控基片表面化學(xué)修飾質(zhì)量探針。（8）內(nèi)標(biāo)探針internalcontrolprobe微陣列基因芯片上用來質(zhì)控檢測過程中核酸提取、擴(kuò)增反應(yīng)、芯片雜交反應(yīng)等過程是否正常探針。（9）陽性質(zhì)控探針positivecontrolprobe設(shè)置在微陣列基因芯片上質(zhì)控探針，不管被檢測樣品結(jié)果怎樣，均能產(chǎn)生能夠被識別信號。（10）陰性質(zhì)控探針negativecontrolprobe設(shè)置在微陣列基因芯片上質(zhì)控探針，不管被檢測樣品結(jié)果怎樣，均不會產(chǎn)生可被識別信號。4.樣本處理4.1樣本類型樣本類型能夠是全血、濾紙干血斑、新鮮組織、穿刺組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、腦脊液、骨髓、羊水、毛囊、精液、糞便、尿液、脫落細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、其它體液（如痰液）等。4.2樣本采集、運(yùn)輸和保留樣本采集、運(yùn)輸和保留須遵照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第四版)》和《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量確保指南》，其中新生兒濾紙干血斑采集須符合《新生兒遺傳疾病篩查血片采集技術(shù)規(guī)范》。樣本采集種類和采集量，如使用經(jīng)CFDA同意商品試劑，須根據(jù)所使用商品微陣列基因芯片檢測試劑盒說明書要求。樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快送至檢測試驗(yàn)室。對于提取DNA樣本，能夠在室溫（18?25℃）下運(yùn)輸，盡可能在8h之內(nèi)抵達(dá)。如條件許可，樣本應(yīng)采取冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。如為RNA，短時(shí)間內(nèi)運(yùn)輸如10min左右，可室溫下運(yùn)輸，如為較長時(shí)間，則應(yīng)在加冰條件下運(yùn)輸，提議在4h送至試驗(yàn)室。如條件許可，應(yīng)使用液氮或保留在特殊試劑中運(yùn)輸。對于檢測靶標(biāo)為DNA樣本，在2～8℃可保留3天。對于檢測靶標(biāo)為RNA樣本，一旦采集送到試驗(yàn)室后，則應(yīng)在-20℃以下凍存。如為血循環(huán)中RNA，最好不要使用血清樣本，而應(yīng)使用EDTA抗凝立即分離后血漿樣本。臨床體液樣本長久（超出兩周）保留應(yīng)在-70℃下。4.3樣本質(zhì)量確保（1）嚴(yán)格根據(jù)樣本采集規(guī)范進(jìn)行采集，正確運(yùn)輸，保留樣本；對采集、運(yùn)輸和保留過程不符規(guī)范樣本，給予拒絕接收。對多種樣本類型應(yīng)按檢測要求建立采集標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。（2）正確進(jìn)行樣本處理，嚴(yán)格根據(jù)核酸提取試劑盒說明書操作。（3）有專用樣本核酸提取操作室，并配置對應(yīng)專用儀器設(shè)備。（4）設(shè)定專員保管制度，具體統(tǒng)計(jì)樣本信息，確保樣本信息不丟失、錯位。4.4樣本信息保留被檢測樣本要求唯一編號，試驗(yàn)前仔細(xì)查對和檢驗(yàn)。試驗(yàn)室須含有樣本保留基礎(chǔ)條件，須配置數(shù)據(jù)保留及確保數(shù)據(jù)安全軟、硬件設(shè)施，相關(guān)數(shù)據(jù)保留不少于5年。5.檢測各步驟分述5.1核酸分離采取微陣列基因芯片說明書要求方法或指定商品化試劑盒。提取RNA時(shí)，須快速滅活RNA酶預(yù)防對RNA降解，須嚴(yán)格遵照已經(jīng)證實(shí)行之有效提取方法和操作規(guī)范，比如須佩戴一次性手套口罩、使用RNase-free試劑耗材等。5.2核酸定量（如適用）使用紫外分光光度計(jì)法或熒光染料法。在檢測核酸濃度時(shí)須注意：一是檢測核酸濃度分光光度計(jì)（或染料法使用酶標(biāo)儀）須建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并注意維護(hù)；二是每次檢測前，須同時(shí)檢測已知濃度對照樣本，確保濃度測定正確。確定特定檢測芯片最低檢測限和檢測范圍，所提取核酸濃度和質(zhì)量須能滿足微陣列基因芯片檢測需要，必需時(shí)純化、稀釋或濃縮。舉例來說，遺傳性耳聾基因檢測芯片能夠設(shè)定最低檢測限為100ng/μL人基因組DNA，檢測范圍為100ng/μL至300ng/μL人基因組DNA，核酸純度OD260/280=1.7-2.0，那么需要從臨床血液樣本中提取核酸，并用分光光度計(jì)測定濃度，進(jìn)行必需純化、稀釋或濃縮以滿足要求；若芯片設(shè)定最低檢測限為2ng/μL人基因組DNA，檢測范圍為2ng/μL至50ng/μL人基因組DNA，核酸純度OD260/280=1.7-2.0，那么能夠從臨床血液、血斑等說明書中標(biāo)識樣本中提取核酸，必需時(shí)用分光光度計(jì)測定濃度，和進(jìn)行純化、稀釋或濃縮以滿足要求。再舉例，檢測結(jié)核分枝桿菌微陣列芯片，對從臨床痰液中提取核酸，若說明書中已經(jīng)要求了具體步驟，并指出無須采取分光光度計(jì)檢測，那么能夠省略核酸定量。5.3核酸擴(kuò)增和標(biāo)識擴(kuò)增反應(yīng)（如PCR、體外轉(zhuǎn)錄等）須遵照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室管理措施》，預(yù)防污染。熒光標(biāo)識為常見樣品標(biāo)識方法，也能夠?qū)怂針悠愤M(jìn)行納米金或磁珠等標(biāo)識。DNA樣品可在核酸擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行標(biāo)識。當(dāng)進(jìn)行RNA表示譜分析時(shí)，首先在體外把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行體外擴(kuò)增和熒光標(biāo)識。必需時(shí)對產(chǎn)物進(jìn)行純化。5.4芯片雜交按對應(yīng)檢測項(xiàng)目標(biāo)操作說明將標(biāo)識擴(kuò)增產(chǎn)物和雜交緩沖液混合，加到微陣列基因芯片上，放置于適宜溫度下雜交。雜交完成后，將芯片進(jìn)行洗滌干燥。5.5信號采集和數(shù)據(jù)分析使用基因芯片熒光掃描儀檢測微陣列基因芯片時(shí)，必需定時(shí)對掃描儀進(jìn)行校準(zhǔn)，通常為每七天一次。設(shè)置適宜掃描參數(shù)，由軟件自動分析得到信號值。需要采取專用算法程序得到檢測結(jié)果，須由專業(yè)人員根據(jù)要求步驟進(jìn)行分析。對于分析軟件判定為檢測失敗或檢測位點(diǎn)信號丟失樣本，須進(jìn)行重新檢測。重新檢測過程同首次檢測一樣，包含核酸提取、擴(kuò)增、標(biāo)識，芯片雜交和后續(xù)圖像掃描及數(shù)據(jù)分析。6.結(jié)果匯報(bào)被檢測樣本檢測匯報(bào)須由專業(yè)結(jié)果匯報(bào)系統(tǒng)根據(jù)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)格式自動打印出匯報(bào)，并給出具體檢測結(jié)果。檢測匯報(bào)必需說明檢測方法不足和適用范圍。檢測匯報(bào)須由專業(yè)人員（含有對應(yīng)資質(zhì)醫(yī)師）向被檢測者進(jìn)行解讀。7.質(zhì)量控制（1）微陣列基因芯片須符合中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會公布《DNA微陣列芯片通用技術(shù)條件》（GB/T28639-）所要求性能要求。在每個(gè)陣列中應(yīng)設(shè)置表面化學(xué)修飾質(zhì)控探針、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針、內(nèi)標(biāo)質(zhì)控探針和空白對照。（2）微陣列基因芯片須經(jīng)過分析性能驗(yàn)證，包含檢測靈敏度、陽性符合率、陰性符合率、批內(nèi)反復(fù)性。用靈敏度參考品對抽檢微陣列基因芯片進(jìn)行檢測，靈敏度測定結(jié)果應(yīng)符合對應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求。用陽性參考品對抽檢微陣列基因芯片進(jìn)行檢測，測定陽性符合率應(yīng)符合對應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求。用陰性參考品對抽檢微陣列基因芯片進(jìn)行檢測，測定陰性符合率應(yīng)符合對應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求。用反復(fù)性參考品對同一批生產(chǎn)最少2張芯片10個(gè)子陣列平行檢測，各次測定結(jié)果應(yīng)正確一致。（3）檢測相關(guān)儀器須取得CFDA醫(yī)療器械注冊證書。儀器需定時(shí)維護(hù)和校驗(yàn)。（4）臨床基因芯片檢測試驗(yàn)室須根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室管理措施》開展室內(nèi)質(zhì)量控制，并參與室間質(zhì)量評價(jià)或進(jìn)行有效試驗(yàn)室間比對。（5）須建立基因芯片診療技術(shù)相關(guān)器材登記制度，確?；蛐酒?、基因提取標(biāo)識和分子雜交試劑起源可追溯。不得違規(guī)反復(fù)使用一次性器材和試劑。（6）檢測人員上崗前須取得臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室技術(shù)人員培訓(xùn)證書，同時(shí)相關(guān)操作須符合《試驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-）。8.注意事項(xiàng)（1）建立健全微陣列基因芯片檢測及相關(guān)數(shù)據(jù)保密制度，對臨床微陣列基因芯片檢測取得基因診療數(shù)據(jù)，應(yīng)確保僅用于被檢者本人診療和基于提升診療水平所進(jìn)行醫(yī)學(xué)科學(xué)研究。未經(jīng)被檢測者許可不得隨意公開，傳輸被檢測者檢測結(jié)果。（2）包含遺傳基因信息臨床檢測項(xiàng)目，被檢者須簽署知情同意書。9.參考文件[1]GB/T27990-，生物芯片基礎(chǔ)術(shù)語。[2]GB/T28639-，DNA微陣列芯片通用技術(shù)條件。[3]GB19489-，試驗(yàn)室生物安全通用要求。[4]衛(wèi)生部辦公廳?；蛐酒\療技術(shù)管理規(guī)范(試行)。[5]衛(wèi)生部辦公廳。醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室管理措施。[6]衛(wèi)生部辦公廳。新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（）。[7]衛(wèi)生部醫(yī)政司。全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第三版)。南京：東南大學(xué)出版社，[9]衛(wèi)計(jì)委醫(yī)政醫(yī)管局。個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量確保指南。待同意。[10]Clinicalandlaboratorystandandsinstitute(CLSI).Diagnosticnucleicacidmicroarrays,approvedguideline.CLSIdocumentMM12-A(ISBN1-56238-60