SNT 1961.6-2013 出口食品過敏原成分檢測 第6部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測胡桃成分

出口食品過敏原成分檢測第6部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法I 第6部分：實(shí)時(shí)熒光PCR方法SN/T1961的本部分規(guī)定了食品中過敏原胡桃成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法。本部分適用于食品原料或加工食品中過敏原胡桃成分的定性檢測。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限(LOD)為0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測也稱核桃屬胡桃科的胡桃屬，共包括12個(gè)種。這1p個(gè)種又被分為4大類，包括英國胡/核桃2均用無DNA酶污染的容器分裝。名稱序列內(nèi)參照探針5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3’5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’5'-(FAM)-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)-3’真核生物.18SrRNA基因胡桃5’端引物胡桃3’端引物胡桃探針5'-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’5'-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’5'-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTC5.2十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammonium5.3三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)。5.4乙二胺四乙酸二鈉(disodiumethylenediaminetetraaceticacid,Na5.1070%乙醇。5.13蛋白酶K溶液(20mg/mL)。5.141.2mol/LNaCl溶液。5.150.1×TE緩沖液(pH8.0):1mmol/LTris,0.1mm6.3實(shí)時(shí)熒光PCR儀。36.9pH計(jì)。7.1.1將樣品用組織研磨器研碎后稱取1g~2g樣品于15mL離心管中，加入5mLCTAB提取緩沖7.1.2以2000g離心10min或更長時(shí)間直至懸浮部分幾近澄清，小心轉(zhuǎn)移上清液1mL至新的空白顛倒混勻，室溫20℃~25℃,孵育60min。異丙醇，顛倒混勻，室溫20℃~25℃,孵育至少20min,以14500g離心至少10min。c=A?6o×N×50當(dāng)濃度為10μg/mL～100pg/mL,Az?0～A2g。比值在1.7～1.9之間時(shí)，適宜于實(shí)時(shí)熒光PCR7.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測7.3.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系7.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)4c)如35.0<Ct值<40.0,則重復(fù)一次。如再次擴(kuò)增后Ct值仍為<40.0,則判定被檢樣品陽性；5(資料性附錄)過敏原胡桃成分的基因擴(kuò)增靶標(biāo)參考序列cgcgcagagaagcagaggccggg