Hp陽性十二指腸潰瘍組織中NOS的表達(dá)

1/1Hp陽性十二指腸潰瘍組織中NOS的表達(dá)Hp陽性十二指腸潰瘍組織中NOS的表達(dá)作者：

范亮苗繼延鄭志漢樊代明楊云生【關(guān)鍵詞】十二指腸潰瘍關(guān)鍵詞:一氧化氮合酶;十二指腸潰瘍;螺桿菌，幽門;免疫組織化學(xué)摘要:目的研究一氧化氮合成酶（NOS，包括n-cNOS，e-cNOS）在Hp陽性的十二指腸潰瘍（DU）組織中的表達(dá)及治療前后的變化;探討DU的發(fā)生與Hp感染的關(guān)系并對其療效、預(yù)后提供參考依據(jù).方法采用免疫組織化學(xué)方法對60例DU胃鏡活檢標(biāo)本觀察其NOS的表達(dá)，包括Hp陽性30例，Hp陰性19例，DU治療前Hp陰性經(jīng)治療后仍為陰性3例，DU治療前Hp陽性經(jīng)治療后轉(zhuǎn)為陰性8例.結(jié)果Hp陽性的DU組織中NOS的陽性反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于Hp陰性的DU組織［n-cNOS:P1lt;0.01vsHp（-）.e-cNOS:P2lt;0.01vsHp（-）］，治療后Hp感染轉(zhuǎn)陰者NOS的表達(dá)有不同程度的減低（n-cNOS:P1lt;0.01vs治療前，e-cNOS:P2lt;0.05vs治療前），而治療后Hp感染仍為陽性者，則無差異.結(jié)論在Hp引起DU的發(fā)病機(jī)制中，NOS可能是其致病因素之一，根除Hp可使DU組織中NOS降低，NOS是否可作為一項(xiàng)DU療效及預(yù)后的指標(biāo)，值得進(jìn)一步探討.Keywords:nitricoxidesynthase;duodenalulcer，helicobac-terpylori;immunohistochemistryAbstract:AIMTostudytherelationshipbetweennitricox-idssynthase（NOS）expressionlevelandHelicobacterpylori（Hp）infectioninpatientswithduodena1ulcer（DU）.METHODSNOSexpressionswerestudiedbyimmunohis-tochemicalmethod.60casesofDUweredividedinto4groups:30casesofHppositivepatients（groupA），19casesofHpnegativepatients（groupB），3casesofHppositivepa-tientswhowereprovedstillHppositiveaftertreatment（groupC），8caseofHppositivepatientswhowereprovedHpnegativeaftertreatment（groupD）.RESULTSNOSexpressionlevelsinHppositivepatientsweresignificantlyhigherthanthoseinHpnegativepatients［n-cNOS:P1lt;0.01vsHp（-）.e-cNOS:P2lt;0.01vsHp（-）］.IngroupC，theNOSexpressionlevelhadnochangesaftertreatment.IngroupD，theNOSexpressiondecreasedatdifferentlevelsaftertreatment（n-cNOS:P1lt;0.01vsbeforetreatment，e-cNOS:P2lt;0.05vsbeforetreatment）.CONCLUSIONNOSmayplayaroleinthemechanismofDUcausedbyHpinfection.ItisworthyoffurtherstudyastowhetherNOScanbeusedassomeindexinthedignosisandprognosisofDU.0引言十二指腸潰瘍（duodenalu1cer.DU）發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全闡明.近年來多數(shù)學(xué)者認(rèn)為幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）是引起DU的因素之一，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果亦支持這一結(jié)論［1］.在Hp感染所引起的DU的發(fā)病機(jī)制中有無NO的參與，目前對此報(bào)道不多.為此，我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測了NOS（n-cNOS，e-cNOS）在Hp感染的DU組織中以及治療前后表達(dá)的情況，為研究DU的發(fā)生與Hp的關(guān)系，并對其療效、預(yù)后提供參考依據(jù).1材料和方法1.1材料病理標(biāo)本取自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科所存1995-08/1997-02胃鏡檢查活檢標(biāo)本共計(jì)60例，其中包括Hp（+）的DU邊緣組織30例，Hp（-）的DU邊緣組織19例;DU治療前Hp（+）經(jīng)過治療后仍為Hp（+）的DU邊緣組織3例，DU治療前Hp（+）經(jīng)治療后轉(zhuǎn)為Hp（-）的DU邊緣組織8例.全部為石臘切片，全部切片經(jīng)病理科高年資醫(yī)師再次閱片重新確診.DU患者治療方法:po洛賽克（omeprazole-Astra）20mg，2次#12539;d-1;阿莫西林（Amo）0.5g，3次#12539;d-1，得樂沖劑（DeNo1）110mg，4次#12539;d-1療程2～4wk，然后復(fù)查胃鏡，并檢測Hp.n-cNOS，e-cNOS兔抗人多克隆抗體（I抗）為美國SantaCurz生物公司產(chǎn)品;ABC試劑及生物素化羊抗兔IgG（Ⅱ抗）為華美生物工程公司產(chǎn)品;3～6一二氨基聯(lián)苯胺（DAB）為瑞士Fluka公司產(chǎn)品.1.2方法采用ABC免疫酶標(biāo)記法［2］，抗血清（I抗）工作濃度為1∶50，用未免疫牛血清做陰性對照，以PBS代替一抗作空白對照.Hp檢測方法，采用尿素酶法及組織學(xué)檢測法，二者均為陽性方定為Hp感染陽性.NOS主要為胞質(zhì)著色，偶有核著色，主要定位于粘膜內(nèi)皮和血管周圍，在固有層中也有部分著色（Fig1）.陽性反應(yīng)按陽性細(xì)胞檢出率及陽性反應(yīng)強(qiáng)度兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行半定量分析.反應(yīng)強(qiáng)度按如下結(jié)果判定:無著色者為陰性（-），淺黃色為弱陽性（+），黃褐色為中度陰性（），深黃褐色為強(qiáng)陽性（）（Fig2）.按有陽性反應(yīng)的例數(shù)計(jì)算陽性反應(yīng)率.圖1－圖2略統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用計(jì)算機(jī)SAS6.11版數(shù)據(jù)系統(tǒng)，陽性細(xì)胞檢出率用四格表精確概率法，陽性反應(yīng)強(qiáng)度采用等級(jí)資料進(jìn)行檢驗(yàn)，兩組樣本采用Wilcoxon等級(jí)資料比較，多組樣本的兩兩比較的秩和檢用Ne-menyi法.2結(jié)果2.1Hp陽性DU組織中n┐cNOS，e┐cNOS的表達(dá)n-cNOS，e-cNOS在Hp（+）與Hp（-）的DU組織中陽性細(xì)胞檢出率無差別（P1=0.363，P2=0.067）.反應(yīng)強(qiáng)度比較:n-cNOS（u=3.039gt;2.58，P1lt;0.01），e-cNOS（u=3.532gt;2.58，P2lt;0.01）;即Hp（+）與Hp（-）的DU組織中的反應(yīng)強(qiáng)度有顯著差異，說明Hp（+）DU組織中e-cNOS，n-cNOS的反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于Hp（-）的DU組織（Tab1）.表1Hp（+）DU組織中n-cNOS，e-cNOS的表達(dá)略2.2Hp陽性DU治療后n┐cNOS，e┐cNOS的表達(dá)n-cNOS在治療前后DU組織中的陽性細(xì)胞檢出率有差異（P1=0.036），即在治療前n-cNOS表達(dá)高，而在經(jīng)過治療后Hp感染轉(zhuǎn)陰的潰瘍組織中表達(dá)降低，e-cNOS則無差異（P2=0.170）.陽性反應(yīng)強(qiáng)度的比較:治療前Hp（+）DU的n-cNOS反應(yīng)強(qiáng)度與治療后Hp轉(zhuǎn)陰的DU的反應(yīng)強(qiáng)度有顯著差異（Plt;0.01），即治療后Hp感染轉(zhuǎn)陰者n-cNOS的反應(yīng)強(qiáng)度明顯減輕;而治療后Hp感染仍為陽性者，則無差異（Pgt;0.05）.治療前Hp（+）Du的e-cNOS反應(yīng)強(qiáng)度與治療后Hp轉(zhuǎn)陰的DU的反應(yīng)強(qiáng)度有差異（Plt;0.05），即治療后Hp感染轉(zhuǎn)陰者e-cNOS的反應(yīng)強(qiáng)度有一定程度的降低，而治療后Hp感染仍為陽性者，則無差異（Pgt;0.05，Tab2）.3討論1980年Furchgott和Zawad發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞能釋放一種舒血管因子（EDRF），但其結(jié)構(gòu)和特性未得到證實(shí)，直到1987年P(guān)almer等［2］和Igrro等［3］分別證實(shí)EDRF是一種氣體物質(zhì)一氧化氮（NO）.NO是在左旋精氨酸在NO合成酶（NOS）的作用下生成的，根據(jù)NOS生物學(xué)特性可將其分為兩種，一種是原生酶（cNOS），它有兩種形式e-cNOS及n-cNOS，主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和血小板等，其活性受Ca2+/CaM的調(diào)控，另一種是誘生酶（iNOS），主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞及各種免疫細(xì)胞等，其酶的活性不依賴于Ca2+/CaM的調(diào)控，但需要有誘導(dǎo)因子的存在［4-7］.NO作為一種神經(jīng)遞質(zhì)和信使分子，具有多種生理功能.在胃腸功能調(diào)節(jié)方面NO起著重要作用［8，9］.一項(xiàng)體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)中的NO在控制腫瘤生長中起重要作用［10］.有報(bào)告提示NOS表達(dá)與肝癌的增殖凋亡有關(guān)，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［11］.一項(xiàng)研究證實(shí)較高水平NOS的表達(dá)提示在肝炎后肝硬化惡性轉(zhuǎn)化及肝癌的進(jìn)展中一氧化氮的產(chǎn)生起一定的作用［12］.另一項(xiàng)研究結(jié)果表明肝硬化大鼠胃腸道各段NOS表達(dá)是降低的［13］.大鼠應(yīng)激后胃粘膜血流量與血漿內(nèi)一氧化氮（NO）較對照組有明顯下降［14］.NO具有擴(kuò)張血管的作用，它可以通過增加胃粘膜的血流量來保護(hù)胃粘膜［15，16］.作者另一研究結(jié)果提示［17］，在Hp促進(jìn)胃癌發(fā)生的過程中，可能有NO的參與，在Hp感染陽性慢性胃炎的發(fā)生中NO發(fā)揮一定作用.有學(xué)者提出Hp感染與作為宿主部分免疫反應(yīng)的反應(yīng)氮類NO和過亞硝酸鹽持續(xù)產(chǎn)物形成有關(guān)［18］.近年來對消化性潰瘍的病因和治療的研究提示，十二指腸潰瘍的發(fā)病不僅與胃酸相關(guān)，而且與Hp感染有關(guān)，乙酰膽堿、組氨和胃粘膜固有層的免疫細(xì)胞和血漿細(xì)胞傳遞到效應(yīng)細(xì)胞，NO可能是介導(dǎo)免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間相互作用的因子［19］.表2Hp（+）DU治療后n-cNOS，e-cNOS的表達(dá)略我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測NOS（包括e-cNOS，n-cNOS，能與人組織反應(yīng)的iNOS缺售）在Hp感染的十二指腸潰瘍組織中及治療前后的表達(dá)情況.結(jié)果顯示n-cNOS，e-cNOS在Hp陽性的十二指腸潰瘍組織與即Hp性的十二指腸潰瘍組織中表達(dá)的陽性細(xì)胞檢出率無差異，但反應(yīng)強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，表明在Hp引起十二指腸潰瘍的發(fā)病機(jī)制中，NO可能是其致病因素之一.結(jié)果還顯示經(jīng)過治療后Hp感染轉(zhuǎn)陰的潰瘍組織中n-cNOS的陽性細(xì)胞檢出率降低，反應(yīng)強(qiáng)度則明顯降低，經(jīng)過治療Hp感染仍為陽性者，則無差異.經(jīng)過治療后Hp感染轉(zhuǎn)陰的十二指腸潰瘍組織中e-cNOS陽性反應(yīng)強(qiáng)度有一定程度的降低，而經(jīng)過治療Hp感染仍為陽性者，則無差異.結(jié)果提示根除Hp可使十二指腸潰瘍組織中NOS降低，即在體內(nèi)亦可誘導(dǎo)酶的活性，而且主要是n-cNOS降低.其機(jī)制可能是:NO與細(xì)胞產(chǎn)生的O2-（過氧化物）相互作用，形成一種超氧亞硝酸化合物，這些化合物性質(zhì)穩(wěn)定，可分解其它細(xì)胞引起組織損傷的產(chǎn)物;NO引起細(xì)胞核酸亞硝酸化，破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu);NO抑制某些與細(xì)胞呼吸和DNA復(fù)制有關(guān)的關(guān)鍵酶活性，使線粒體呼吸鏈的正常功能受到抑制和靶細(xì)胞中鐵的喪失，表現(xiàn)出細(xì)胞毒性及組織損傷;NO作用于生物氧化過程中線粒體內(nèi)的烏頭酸酶和琥珀酸氧化還原酶時(shí)，可抑制細(xì)胞的生物氧化產(chǎn)能，從而影響細(xì)胞的生長、發(fā)育和增殖等，甚至引起細(xì)胞死亡.Hp感染陽性的十二指腸潰瘍組織中NOS的表達(dá)降低，NOS是否可做為一項(xiàng)十二指腸潰瘍療效及預(yù)后的指標(biāo)，值得進(jìn)一步探討.參考文獻(xiàn):［1］ZhouDY，YangHT，ZhangWD.Helicobacterpyloriandgas-troduodenalulcer［M］.Shanghai:ShanghaiKexueJishuChubanshe（Shanghai:ShanghaiScienceandTechnologyPress，）1992:276.［2］PalmerRMJ，F(xiàn)errigeAG，Moncadas.Nitricoxidereleasea-countsforthebiologicalactivityofendothelium-derivedrelaxingfacter［J］.Nature，1987;327:524.［3］IgnarroLJ，BugaGM，Woodks.Endothelium-derivedrelaxingfacterproducedandreleasedfromarteryandveinisnitricoxide［J］.NatlAcadSciUSA，1987;84:9265.［4］TengB，MurthyKS，KuemmerleJF，GriderJR，SaseK，MichelT，MakhloufGM.Expressionofendthelialnitricoxidesynthaseinhumanandrabbitgastrointestinalsmoothmusclecells［J］.AmJPhysiol，1998;275（2Pt1）:G342-G351.［5］BarbiersM，TimmermansJP，ScheuermannDW，AdriaensenD，MayerB，DeGroodt-LasseelMH.Nitricoxidesynthasecon-tainingneuronsinthepiglargeintestine:Topography，mor-phology，andviscerofugalprojections［J］.MicroscResTech，1994;29（2）:72-78.［6］GenescaJ，GonzalezA，SeguraR.Interlukin-6，nitricoxide，andtheclinicalandhemodynamicalteratiouofpatientswithlivercirrhosis［J］.AmJGastroenterol，1999;94（1）:169-177.［7］SarelaAI，MihaimeedFM，BattenJJ，DavidsonBR，MathieRT.Hepaticandsplanchnicnitricoxideactivityinpatientswithcirrhosis［J］.Gut，1999;44（5）:749-753.［8］EkblaolE，MulderH，UddmanR，SundlerF.NOS-containingneuronsintheratgutandcoeliacganglia［J］.Neuropharma-cology，1994;33（11）:1323-1331.［9］JarvinenMK，WollmannWJ，PowrozekTA，SchultzJA，Pow-leyTL.Nitricoxidesynthase-containingneuronsinthemyen-tericplexusoftheratgastrointestinaltract;Distributionandre-gionaldensity［J］.AnatEmbryolBerl，1999;199（2）:99-112.［10］WinkDA，VodovotzY，CookJA.Theroleofnitricoxidechem-istryincancertreatment［J］.BiochemistryMosc，1998;63:802-809.［11］ChengTM，YuanAL，LiCL，PanSL，LiouXX.Theexpres-sionofnitricoxidesynthaseanditsassociationwithproliferationandapoptosisofHCCcells［J］.ZhonghuaXiaohuaZazhi（ChinJDig），2000;20（5）:315-317.［12］WandL，TangZQ，SunHC，YueSL，JY，LuHF，ShiDR.Ni-tricoxidesynthaseandvascularendothelialgrowthfactorex-pressioninhepatocellularcarcinomaandtheirrelationtoangio-genesis［J］.ChinJOncol，2000;22（4）:301-303.［13］WangX，WenQS，HuangYX.L-NAMEandexpressionofNOSisoformsincirrhoticratintestines［J］.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2001;22（9）:817-820.［14］YangQ，QinM，HuangYX，WangJJ，ZhaoBM，GaoW，WangQL.Electroacupunctureandgastricmucosalbloodflowand