3.2基因工程的基本操作程序第三步（第五課時）課件高二下學期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程13.2基因工程的基本操作程序第三步將目的基因導入受體細胞2基因表達載體的構建3將目的基因導入受體細胞4目的基因的檢測與鑒定1目的基因的篩選與獲取基因工程培育抗蟲棉的思路：蘇云金桿菌提取Bt抗蟲蛋白基因導入棉花細胞抗蟲棉Bt基因表達2常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。方法植物細胞：動物細胞：微生物細胞：花粉管通道法、農桿菌轉化法顯微注射技術Ca2+處理法(感受態(tài)細胞法)由于受體細胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因導入受體細胞的方法不同，因此，基因表達載體的構建也會有差別。2基因表達載體的構建3將目的基因導入受體細胞4目的基因的檢測與鑒定1目的基因的篩選與獲取3將目的基因導入受體細胞——植物細胞:花粉管通道法1.花粉管通道法我國科學家獨創(chuàng)的一種方法。②可以在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。4①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。將目的基因導入受體細胞——植物細胞:花粉管通道法優(yōu)點①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，將外源基因攜帶進

入胚囊，此時的受精卵未形成細胞壁，且正在進行活躍的DNA復制，容易將外源DNA片段整合到受體基因組中。②操作簡單、技術成本低，免去了組織培養(yǎng)以及誘導再生植株

的全套人工培養(yǎng)過程。受體細胞：受精卵5將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法2.農桿菌轉化法①農桿菌特點：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對大多數____________沒有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物隨著轉化方法的突破，農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。采用最多將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法2.農桿菌轉化法b.當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量酚類化合物，吸引農桿菌移向這些細胞，農桿菌能將Ti質粒上的T-DNA(可轉移的DNA)

轉移到被侵染的細胞，并將其整合到該細胞的DNA上。①農桿菌特點：將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法2.農桿菌轉化法②載體：農桿菌Ti質粒（T-DNA)·毒性區(qū)(vir區(qū))︰激活T-DNA的轉移·T-DNA區(qū):侵染植物時，從Ti質粒上被切割，轉移到植物細胞中，帶有與腫瘤形成有關的基因。該區(qū)內基因表達調控序列與真核生物類似，因而可以不在農桿菌中表達而在植物中表達。將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法2.農桿菌轉化法將目的基因插入__________________中，通過農桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達。③利用農桿菌進行轉化的思路：Ti質粒的T-DNA轉化進入植物細胞轉化目的基因進入____________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程。受體細胞穩(wěn)定表達此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒表現出新性狀的植株導入植物細胞植物細胞將目的基因插入染色體DNA中目的基因Ti質粒T-DNA含重組Ti質粒的農桿菌轉入農桿菌過程Ti質粒目的基因構建基因表達載體轉入農桿菌導入植物細胞T-DNA攜帶目的基因插入植物細胞染色體DNA中表達新性狀植物組織培養(yǎng)將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法⑤方法①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉化細胞，并再生成植株；②可以將花序直接浸沒在含有農桿菌的溶液一段時間，然后培植植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。受體細胞為_______體細胞受體細胞為_______受精卵11將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉化細胞，并再生成植株；將目的基因導入受體細胞——農桿菌轉化法12可以將花序直接浸沒在含有農桿菌的溶液一段時間，然后培植植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。將目的基因導入受體細胞——農桿菌轉化法13該過程經過____次拼接、____次導入？(1)第一次拼接______________________________________________________________________(2)第二次拼接______________________________________________________________________(3)第一次導入_____________________________________________________________________(4)第二次導入____________________________________________________________________將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）將目的基因導入受體細胞——植物細胞:農桿菌轉化法【P83拓展應用】

提示：外源基因插入基因組中可能為單位點插人，或者同一染色體多位點插入，或者不同染色體多位點插入。大多數情況下，插入的位點難以做到定點插入;插入的拷貝數也是隨機的。因此，外源基因在轉基因植物中的遺傳是很復雜的。

例如，科研人員在對轉GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因）的煙草進行基因表達分析時，發(fā)現部分轉基因植株的染色體DNA中整合了多個拷貝的基因，從而導致GUS基因失活。除此之外，外源基因丟失、基因重排等也都可能影響外源基因的穩(wěn)定性。15將目的基因導入受體細胞——動物細胞顯微注射法受精卵注射器固定吸管顯微注射儀將含有目的基因的表達裁體提純→顯微注射入動物的受精卵→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物受體細胞：受精卵16將目的基因導入受體細胞——微生物細胞1.原核生物的作為受體細胞的優(yōu)點①繁殖快②單細胞③遺傳物質少2.導入方法：Ca2+處理法(感受態(tài)細胞法)大腸桿菌感受態(tài)細胞Ca2+混合表達載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉化使大腸桿菌處于一種易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒進入宿主細胞。17將目的基因導入受體細胞——微生物細胞胰腺提取篩選胰島素mRNA胰島素cDNA逆轉錄重組質粒質粒導入大腸桿菌mRNA胰島素原胰島素加工用原核生物生產胰島素示意圖注：原核生物作為受體細胞產生的真核生物的蛋白質通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。18受體細胞植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法、花粉管通道法顯微注射技術Ca2+處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程以農桿菌轉化法為例：將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上↓轉入農桿菌中↓導入植物細胞↓整合到受體細胞的DNA上提純含目的基因的表達載體↓顯微注射↓受精卵發(fā)育↓具有新性狀的個體Ca2＋處理細胞↓感受態(tài)細胞↓基因表達載體與感受態(tài)細胞混合↓