3.1.3重組DNA技術(shù)的基本工具（DNA粗提取和鑒定限制酶的選擇）高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程重組DNA技術(shù)的基本工具（DNA粗提取和鑒定+限制酶的選擇）板展：1.基因工程的工具？

運(yùn)載體包括？2.按其來源不同，DNA連接酶有兩類，即______和_______，其中后者只能連接一種末端。3.運(yùn)載體具備的條件及目的？4.右圖：EcoRⅠ限制酶的切點(diǎn)是___________之間。5.若質(zhì)粒的切割末端為

,則與之連接的用同一種酶切割的目的基因的切割末端應(yīng)為___________。該酶的識(shí)別序列為______________。6.某限制酶識(shí)別序列是—↓GATC—；畫出用該限制酶切割獲得的DNA片段？7.質(zhì)粒用EcoRⅠ切割后產(chǎn)生的片段如下:為使運(yùn)載體與目的基因相連,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,還可用另一種限制性核酸內(nèi)切酶切割,該酶的特點(diǎn)？切割產(chǎn)生的DNA片段末端與EcoRⅠ切割產(chǎn)生的相同用同種酶切割的目的是：產(chǎn)生相同末端，便于連接。缺點(diǎn)：容易發(fā)生①目的基因自身環(huán)化

②質(zhì)粒自身環(huán)化

③目的基因與質(zhì)粒反向連接?！靖倪M(jìn)：使用兩種產(chǎn)生不同末端的酶分別切割質(zhì)粒、目的基因】1.目的基因自身環(huán)化2.載體自身環(huán)化3.目的基因與載體正向連接4.目的基因與載體反向連接(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中

；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇

和

兩種限制酶。(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇

，而不選擇

。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇

。PstⅠSmaⅠSmaⅠPstⅠPstⅠEcoRⅠ看書范圍：P74“探究

實(shí)踐”【6分鐘】1.第一段：找出DNA粗提取原理

鑒定原理2.3.實(shí)驗(yàn)步驟：（1）圈出每步用到的試劑——作用是？（2）每步DNA存在于溶液中還是沉淀物中？（4）步驟4——完成表格導(dǎo)思1.已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。質(zhì)粒用限制酶_____切割，目的基因用限制酶_______切割。議2.若利用酶切法獲得目的基因，最應(yīng)選擇的限制酶是__________和______________。3.用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用__________兩種限制酶切割。4.為實(shí)現(xiàn)M蛋白基因與質(zhì)粒連接，切割質(zhì)粒。選用的限制酶是_____________。切割質(zhì)粒時(shí)選用不選用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________。5.目的基因接入質(zhì)粒的方式理論上有兩種：正向連接和反向連接。若正向連接轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列是5’-AAUUGGCC-3’，則反向連接時(shí)，轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列是？反向連接導(dǎo)致目的基因表達(dá)出不同蛋白質(zhì)的原因是？自由展1.已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。質(zhì)粒用限制酶______切割，目的基因用限制酶_________切割。2.若利用酶切法獲得目的基因，最應(yīng)選擇的限制酶是____________________。展1IIIMspISmaI_3.用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用_________________兩種限制酶切割4.為實(shí)現(xiàn)M蛋白基因與質(zhì)粒連接，切割質(zhì)粒。選用的限制酶是_____________。切割質(zhì)粒時(shí)選用不選用限制酶SmaⅠ的原因是____________________________。展2BclIHindIII_BglIIXmaI_SmaI切割后產(chǎn)生平末端，不能與目的基因連接_5.限制酶的選擇：若用下圖中的質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組DNA，分析：（1）能否選用SmaI進(jìn)行切割？不能

原因？①會(huì)破壞目的基因

②質(zhì)粒上無該酶切割位點(diǎn)（2）能否選用EcoRI和HindⅢ共同切割,原因？切割后無標(biāo)記基因（3）若單獨(dú)使用HindIII分別切割目的基因和載體，則會(huì)出現(xiàn)下列哪些片段？①載體自身環(huán)化②目的基因環(huán)化③目的基因與載體正向連接④目的基因與載體反向連接（4）單獨(dú)使用HindIII分別切割目的基因和載體，攜帶CDKN2B基因的重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)約一半細(xì)胞中沒有檢測(cè)到CDKN2B蛋白，原因是④目的基因與載體反向連接為避免這種現(xiàn)象發(fā)生，改進(jìn)措施是同時(shí)選用PstIEcoRI酶分別對(duì)目的基因和載體進(jìn)行酶切？（5）結(jié)合上述分析，與單獨(dú)使用HindIII相比,用兩種酶切的優(yōu)勢(shì)是？【高頻二卷】①避免載體自身環(huán)化（1分

）；

②避免目的基因環(huán)化（1分）；③避免目的基因與載體反向連接（1分）。展3評(píng)1（一）限制酶的選擇1.總結(jié):限制酶選擇的要求：①選擇的酶切位點(diǎn)不能破壞目的基因、復(fù)制原點(diǎn)。②至少保留一個(gè)標(biāo)記基因。2.注意方向性:A．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體B用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體5.目的基因接若正向連接轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列是5’-AAUUGGCC-3’，則反向連接時(shí)，轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列是3’-UUAACCGG-5’。反向連接導(dǎo)致目的基因表達(dá)出不同蛋白質(zhì)原因：反向連接轉(zhuǎn)錄出的mRNA不同評(píng)2（二）DNA粗提取和鑒定1.DNA粗提取的原理：①DNA不溶于酒精,但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。②DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，在2mol/LNaCl溶液中溶解度最大。2.DNA鑒定原理；在_沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈_藍(lán)_色。（二苯胺現(xiàn)配現(xiàn)用?。?.本實(shí)驗(yàn)可選用【洋蔥

菠菜

豬肝

大腸桿菌、雞血】

：原因DNA含量豐富。

不能選用豬血/兔血,原因：_哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核和眾多細(xì)胞器，DNA含量少。4.步驟：【步驟1】若為雞血，加入蒸餾水目的是使雞血細(xì)胞_吸水漲破_，釋放出DNA。若材料是洋蔥，則需倒入研磨液后充分研磨?！贋V紙（1）析出DNA時(shí)，加入95%的冷酒精。（2）預(yù)冷酒精優(yōu)點(diǎn)是①抑制DNA水解酶的活性，防止DNA降解；②降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀_析出_；③有利于增加DNA柔韌性，減少_DNA斷裂。評(píng)3【步驟4】2mol/L的Nacl溶液不處理加入絲狀物二苯胺沸水浴冷卻顏色不出現(xiàn)藍(lán)色出現(xiàn)藍(lán)色是否加入DNA判斷

1.可將洋蔥置于清水中，細(xì)胞吸水破裂后將DNA釋放出來

×植物有壁，不會(huì)漲破2．將含DNA的上清液加入95%的冷酒精會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物√3.鑒定DNA時(shí)，應(yīng)將絲狀物直接加入二苯胺試劑中并進(jìn)行沸水浴×加入2mol/LNaCl4.鑒定時(shí)加入二苯胺后沸水浴即可觀察到較為明顯的顯色反應(yīng)×P75沸水浴5min，冷卻5．將DNA絲狀物溶于2molL的NaCl中，沸水中加熱5min可觀察到溶液變藍(lán)

×加入二苯胺試劑6.將白色絲狀物溶解在NaCl中，加入二苯胺試劑夠震蕩，觀察顏色變化?！练兴?．將研磨液加入切碎的洋蔥，充分研磨后過濾，要棄去上清液×研磨后DNA在濾液8．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀×DNA在研磨液中——為除去細(xì)胞結(jié)構(gòu)等雜質(zhì)9．鑒定粗提取的DNA時(shí)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的區(qū)別是加不加二苯胺試劑

×自變量：有無加入DNA10.使用二苯胺試劑能有效測(cè)定不同提取液中DNA的純度差別

×二苯胺顏色深淺反映DNA的量≠DNA的純度【看提取物顏色】

11.濾液中加入冷酒精后，用玻璃棒攪拌會(huì)使DNA的提取量增加?！?2.用EcoRV(-GAT↓ATC-)切割產(chǎn)生的片段和SmaI(-CCC↓GGG-)切割產(chǎn)生的DNA片段可以相連接

√

T4DNA連接酶連接平末端時(shí)，對(duì)兩側(cè)序列沒要求。檢檢1.DNA粗提取的原理？①DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。②DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，在2mol/LNaCl溶液中溶解度最大。2.DNA鑒定的原理？在沸水浴條件下，DNA與二苯胺試劑反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色。3.實(shí)驗(yàn)中向研磨液中加入95%的冷酒精析出DNA，依據(jù)的原理是DNA不溶于酒精，而蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)溶于酒精。4.預(yù)冷酒精優(yōu)點(diǎn)是①抑制DNA水解酶的活性，防止DNA降解；②降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀_析出_③利于增加DNA柔韌性，減少_DNA斷裂。5.獲取目的基因和切割載體時(shí)，通常使用同一種限制酶，目的產(chǎn)生相同的末端，便于連接。但是使用該方法的缺點(diǎn)是容易發(fā)生①目的基因自身環(huán)化

②質(zhì)粒自身環(huán)化

③目的基因和質(zhì)粒反向連接。為了避免上述情況的發(fā)生，可采取的措施是：分別用兩種限制酶去切割目的基因和載體。6.