分子生物學(xué)診斷技術(shù)在血栓-止血性疾病中的應(yīng)用

主要內(nèi)容分子生物學(xué)診斷技術(shù)的基本原理遺傳性血栓-止血相關(guān)疾病及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)分子生物學(xué)診斷技術(shù)在血栓-止血相關(guān)疾病的應(yīng)用1.基因診斷定義:

是指應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，從DNA/RNA水平檢測分析致病基因的存在、變異和表達(dá)狀態(tài)，從而達(dá)到診斷和鑒別疾病的目的。1.基因診斷特點：病因?qū)W診斷、基因型診斷、特異性高應(yīng)用優(yōu)勢：遺傳病的產(chǎn)前診斷、病原微生物感染的潛伏期診斷、攜帶者檢查、家系調(diào)查、預(yù)測和早期發(fā)現(xiàn)疾病基因診斷的特點在分子水平上對疾病發(fā)生的原因作“基因型”診斷對材料的要求無組織特異性基因診斷無個體發(fā)育時限性基因診斷DNA診斷分析基因的結(jié)構(gòu)RNA診斷分析基因的功能2.血栓-止血相關(guān)疾病基因診斷必要性生活方式遺傳性易栓素質(zhì)遺傳性出血素質(zhì)發(fā)病刺激因素基因診斷遺傳給后代產(chǎn)前診斷分子生物學(xué)診斷技術(shù)的基本原理核酸雜交技術(shù)（Hybridization）基本原理：

不同來源的兩條互補(bǔ)核苷酸鏈在一定條件下形成雙鏈分子的過程。以標(biāo)記的已知核酸片段為探針，與待測標(biāo)本核酸進(jìn)行雜交，通過放射自顯影，即可觀察到樣本核酸中相應(yīng)的基因。核酸探針：

帶有可檢測性標(biāo)記物的已知核苷酸序列核酸雜交技術(shù)（Hybridization）堿基互補(bǔ)配對原理：AT

CG變性(Denature)：待測dsDNA轉(zhuǎn)變成單鏈的過程復(fù)性(Renature)：雜化雙鏈DNA形成的過程聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerasechainreaction，PCR）其本質(zhì)是分子核酸雜交原理和過程與細(xì)胞周期DNA復(fù)制相似區(qū)別在于DNA在不同溫度下快速復(fù)性變性，使DNA的復(fù)制在體外高速進(jìn)行PCR（Polymerasechainreaction）：延長(72℃3分鐘)(Elongation)變性(90℃1分鐘)(Denature)退火(52℃，2分鐘)（Annealing）外源DNA作模板過量引物四種dNTPs作原料耐熱TaqDNA聚合酶Mg2+目的——獲得高濃度的目的DNA片段PCR原理模板DNA變性與引物復(fù)性引物延伸與新鏈合成3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’PCR的應(yīng)用1。診斷基因缺失利用DNA缺失區(qū)域5’和3’端引物進(jìn)行PCR，通過凝膠電泳觀察擴(kuò)增片段出現(xiàn)與否，以及片段大小，可診斷中等程度的DNA片段缺失。PCR的應(yīng)用2。診斷已知點突變DNA測序（DNASequencing）雙脫氧核苷酸末端終止法2’,3’-ddNTP

電泳方向判讀方向模板：待測DNA片段(TACCAGTATCGACAAA)原料：dNTPs和ddNTP引物：DNA聚合酶：四個反應(yīng)體系：判讀：ATGGTCATAGCTGTTT超薄聚丙烯酰胺-尿素凝膠電泳等位基因特異性PCR（AS-PCR）和

PCR等位基因寡核苷酸技術(shù)同時使用正常和突變的探針或引物檢測已知突變。限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLPs)——特異性內(nèi)切酶的消化作用于正常和患者的特異DNA并切割成不同數(shù)量/長度大小的片段，通過凝膠電泳和探針雜交可予以鑒別限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLPs)檢測原理：

HNMH：突變雜合子N：野生型M：突變純合子限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLPs)應(yīng)用前提：基因突變已知該突變改變了原有的限制性酶切位點應(yīng)用局限性：一次只能完成一個特定位點突變篩查，檢測效率較低僅適于基因突變類型單一所致的遺傳病診斷基因連鎖分析技術(shù)利用與致病基因緊密連鎖和共同傳遞的一系列基因組遺傳多態(tài)標(biāo)記，通過檢測家系先證者，明確與致病基因相關(guān)的遺傳標(biāo)記的特點，進(jìn)而對家系中其他患者的遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測，做出診斷?；蜻B鎖分析技術(shù)其基本思路：一個家系中有親緣關(guān)系的個體同時患一種遺傳病，其基因異常是共同的致病基因內(nèi)及兩側(cè)遺傳距離極小的多態(tài)標(biāo)記與致病基因緊密連鎖，共同傳遞先證者遺傳標(biāo)記的特點可被確定遺傳標(biāo)記的特點在群體中呈多態(tài)分布基因連鎖分析技術(shù)X連鎖隱性遺傳病的基因連鎖分析先證者先證者之父先證者之母待檢者第二個患者結(jié)論：待檢者為女性致病基因攜帶者PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)

原理：

單鏈DNA分子單個堿基或多個堿基的變異，即可引起其構(gòu)象改變，使其在PAGE中的遷移率發(fā)生變化。

過程：

PCR—變性成單鏈—PAGE—EB染色或銀染

PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)應(yīng)用與評價：同時將正?；虻腜CR產(chǎn)物作電泳對照；缺陷是敏感性低（其敏感性隨DNA長度增加而降低，受檢片段最適長度約為300bp）；不能確定突變類型及部位；常結(jié)合DNA測序以確定突變位點及性質(zhì)原理：DNA雙鏈的解鏈溫度（Tm）取決于核苷酸順序，基因突變的存在可使其所在區(qū)域的Tm值隨之改變。雙鏈DNA置于含有遞增濃度變性劑的PAGE中電泳，Tm值低的區(qū)域在較低變性劑濃度中先解鏈，Tm值高的區(qū)域后解鏈，解鏈可導(dǎo)致DNA遷移率下降。根據(jù)DNA雙鏈在DGGE中泳動速率的改變而推知Tm值發(fā)生了改變，進(jìn)而找出突變型DNA。

PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

評價與應(yīng)用：與SSCP相比之下，此法更精確，可檢測片段長度達(dá)600bp。反應(yīng)條件初始化較為復(fù)雜。凝膠制備要一定的設(shè)備。難以檢測GC含量豐富的DNA片段。二、血栓-止血相關(guān)疾病及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)常見的致病基因突變(GeneMutation)點突變(PointMutation)：

分類：錯義突變無義突變插入突變(Insertion)：大/小片段缺失突變(Deletion)：大/小片段倒位(Inversion)：FVIII基因內(nèi)含子22的倒位

檢測：直接法—SCCP/DGGE+測序間接法—多態(tài)性分析（RFLPs/VNTR/STR)2.常見遺傳性易栓癥的分子基礎(chǔ)蛋白C抵抗綜合征(1993)——FVLeiden

FV基因第1691位核苷酸突變，產(chǎn)生Arg506-GlnFV的Arg506是APC滅活FV的作用位點該突變不影響FVa的凝血功能

凝血酶原G20210A凝血酶原基因3’未翻譯區(qū)的20210位點G-A該類患者血漿凝血酶原含量增高發(fā)病率為5.5-7.1%血栓形成危險性增高3-5倍分子基礎(chǔ)危險性增加倍數(shù)普通人群發(fā)生率占非選擇患者占遺傳性患者蛋白C抵抗綜合征FVLeidenG1691A純合子:50~100雜合子:3~7Caucasians5%亞非<1%20%>52%凝血酶原G20210A3’端非翻譯區(qū)20210A2~5Caucasians2%-7%高同型半胱氨酸血癥MTHFRC677T2~3?5~15%4~10%-先天性抗凝血酶缺乏高度異質(zhì)性Caucasians0.04%1%5.3%Caucasians0.3%3%7.9%先天性蛋白C缺乏-1.5%7.2%先天性蛋白S缺乏表遺傳性血栓性疾病的分子基礎(chǔ)等3.常見遺傳性出血性疾病的分子基礎(chǔ)血管性假血友病(vWD)：最常見I型：高度異質(zhì)性；II型：相對保守III型：相對保守血友?。篨-連鎖隱性遺傳血友病A(HA)——FVIII缺乏輕~中度：高度異質(zhì)性（點突變）重度：內(nèi)含子22倒位占50%血友病B(HB)——FIX缺乏，1/3為散發(fā)病例（180個短插入/缺失突變，79個長插入/缺失突變，點突變最多）

三、分子生物學(xué)診斷技術(shù)的應(yīng)用1.遺傳性血栓性疾?。ㄒ姿òY）的基因診斷舉例——蛋白C抵抗綜合征常規(guī)篩選診斷試驗：血漿功能試驗即APTTratio(WithAPC/WithoutAPC)——Sen和Spe接近100%基因確定診斷：DNA

PCR分析可以明確區(qū)分正常（0拷貝）、雜合子攜帶者（單拷貝）和純合子患者（雙個拷貝）基因診斷原理包括：PCR等位基因特異性RFLPs等位基因特異性PCR擴(kuò)增等位基因特異性雜交（膜/微量滴定板）2.出血性疾病的基因診斷HA的基因診斷HB的基因診斷vWD的基因診斷HA的臨床血友病A(hemophiliaA，HA)是一種常見的X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，患病率為l／10000（男性），約占先天性出血性疾病的85％。主要病因由于FVIII基因缺陷而引起凝血功能障礙，病人出現(xiàn)自發(fā)性或輕微外傷后出血不止HA的常規(guī)診斷臨床懷疑：自發(fā)性或輕微外傷后出血不止的癥狀或病史；家族史篩選試驗：PT正常、APTT延長確診試驗：STGT、FVIII:C、FVIII：AgFXFXaFIXaFVIIIaCa2+/PLHA的分子生物學(xué)特性FVIII基因:

Xq28，26個外顯子和25個內(nèi)含子，全長186kb；其mRNA長9kb突變：點突變數(shù)百種缺失或插入突變內(nèi)含子22的基因倒位血友病A的基因診斷一、直接檢測基因突變1。小片段基因改變的檢測PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)在輕中度HA患者的突變檢出率為70%變性梯度凝膠電泳（DGGE）在輕中度HA患者的突變檢出率為86%血友病A的基因診斷一、直接檢測基因突變2。內(nèi)含子22基因倒位的檢測Southernblot基因內(nèi)大片段倒位的存在，引起限制性內(nèi)切酶譜的改變，用限制性酶消化DNA，基因探針雜交的方法，即Southernblot檢測內(nèi)含子22基因倒位。先證者的未知突變篩選（直接診斷）構(gòu)象敏感性分析（1）PCR-SSCP：敏感性低、需正常對照、結(jié)合測序（2）PCR-DGGE：正常對照、掃描整個序列（敏感性高）DNA直接測序

實現(xiàn)自動化、和上述分析相結(jié)合、確定突變位點和性質(zhì)圖內(nèi)含子22倒位的機(jī)理內(nèi)含子22倒位的檢測方法1

——Southern印跡法

BclI酶切，F(xiàn)8A探針雜交表型：正常人kb(22h1),14kb(22h2),16kb(22h3)Ⅰ型倒位(85%)：20

Ⅱ型倒位(15%)：20kb,15.5kb,16kb

評價：簡明、直接；費(fèi)時費(fèi)力、復(fù)雜；DNA用量大、昂貴、放射性應(yīng)用：基因診斷重型HA病人及其家系成員的遺傳咨詢內(nèi)含子22倒位的檢測方法2——長距離PCR引物：P、Q、A、B

P/Q只特異于內(nèi)含子22中h1kb處的序列；A/B則特異于FVIII基因上游h2及h3兩側(cè)各約100~200bp處的序列表型：

正?！?2kb(PQ);10kb(AB)患者——11kb(PB+AQ);10kb(AB)攜帶者——12kb(PQ);11kb(PB+AQ);10kb(AB)長距離PCR評價

DNA用量少、簡便快速、高效直觀、靈敏準(zhǔn)確、不需要放射性核素及便于推廣等；無法獲得先證者的DNA樣品或連鎖分析未能提供雜合性信息的情況下，LD-PCR技術(shù)亦能進(jìn)行攜帶者檢測和產(chǎn)前基因診斷，因此近年被認(rèn)為是基因診斷重型HA的首選方法。圖LD-PCR分析

M：標(biāo)準(zhǔn)；II-1：先證者之父親；II-2：先證者之母親；III-1：先證者；III-2：母親正孕的男孩

改良引物：P、Q、B血友病A的基因診斷二、利用基因多態(tài)性連鎖分析進(jìn)行間接診斷前提：存在先證者；母親是該突變位點的雜合子（1）PCR-RFLP：

int18/BclⅠ；int22/XbaⅠ;

int19/HindⅢ（2）PCR-VNTR：

TaqⅠ/DXS52（St14）基因外（3）PCR-STR：

int13(CA)n;int22(GT)n(AG)nn有種族差異

圖

BclIRFLP分析結(jié)果

M：標(biāo)準(zhǔn)；II-1：先證者之父親；II-2：先證者之母親；III-1：先證者；III-2：母親正孕的男孩

圖

St14VNTR分析結(jié)果

M：標(biāo)準(zhǔn)；I-1：先證者之外公；I-2：先證者之外婆；II-1：先證者之父親；II-2：先證者之母親；II-3/4：II-2的姐妹；III-1：先證者

診斷策略重型HA患者22倒位LD-PCR分析輕中型HA患者基因多態(tài)性分析家系調(diào)查產(chǎn)前診斷突變篩查、測序陽性陰性方法選擇LD-PCR法是基因診斷重型HA家系的首選方法.單獨(dú)使用基因內(nèi)或與其緊密連鎖的任何一種RFLP都不可能保證攜帶者為其雜合子，因此實際工作中常需要2~3組，甚至更多的RFLP聯(lián)合使用以提高診斷率對非倒位或輕、中型HA家系則采用PCR-RFLP法和二核昔酸重復(fù)序列多態(tài)性（STR）進(jìn)行連鎖分析，而不首選St14VNTR法；只有當(dāng)用前兩種方法仍不能診斷者，才采用之，以防誤診標(biāo)本來源成人外周血：2%EDTA生理鹽水抗凝或ACD（1：9）抗凝胎兒臍靜脈血：孕19后B超監(jiān)測下經(jīng)腹壁絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞：羊水細(xì)胞：孕16周后取20ml羊水穿刺液HB的臨床血友病B(hemophiliaB，HB)是一種常見的X連鎖隱性遺傳性出血性疾病，患病率為l~1.5／100000，約占先天性出血性疾病的15％。主要病因由于FIX基因缺陷而引起凝血功能障礙，病人出現(xiàn)自發(fā)性或輕微外傷后出血不止，癥狀較HA輕。HB的分子生物學(xué)特性FIX基因：

位于Xq26.3-27.1,與HGPRT（次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）、脆性X、色盲、G6PD以及FⅧkb，8個外顯子、7個內(nèi)含子以及側(cè)翼區(qū)；cDNAkbFIX蛋白：

FIX蛋白前體長461個aa,成熟蛋白質(zhì)長415個aa突變：

共計600多種，其中點突變占80%，此外還有大/小片段缺失/插入突變等；突變位置可見于啟動子區(qū)、剪接區(qū)、催化區(qū)或功能區(qū)等，其中催化區(qū)報道最多圖FⅨ基因及蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

HB的常規(guī)診斷臨床懷疑：自發(fā)性或輕微外傷后出血不止的癥狀或病史；家族史篩選試驗：PT正常、APTT延長確診試驗：STGT、FIX:C活性減低FXFXaFIXaFVIIIaCa2+/PLHB的基因診斷突變篩選：構(gòu)象敏感性凝膠電泳分析和DNA直接測序（FIX基因較?。┡詳y帶者篩查：確定是