ＤＮＡ粗提取和鑒定實驗設(shè)計與改進(jìn)高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

ＤＮＡ粗提取和鑒定實驗設(shè)計與改進(jìn)本實驗為高中生物學(xué)選擇性必修３《生物技術(shù)與工程》中基因工程的實驗內(nèi)容。該實驗可以讓學(xué)生更加直觀地通過觀察掌握ＤＮＡ的理化性質(zhì)，也是基因工程中獲取目的基因必不可少的實驗步驟。然而，該實驗本身屬于粗提取，最終得到的ＤＮＡ雜質(zhì)含量較多，會影響ＤＮＡ沉淀的溶解和后續(xù)的二苯胺顯色反應(yīng)，也無法繼續(xù)用做基因工程的實驗材料。對ＤＮＡ粗提物進(jìn)行純化，并利用超微量紫外可見分光光度計進(jìn)行ＤＮＡ純度的檢測，獲得了較純的基因組ＤＮＡ，進(jìn)一步提升了該實驗的教學(xué)價值，有利于學(xué)生通過實驗充分掌握ＤＮＡ的性質(zhì)及其提取的原理，得到的基因組ＤＮＡ也可以用于基因工程的其他實驗，如作為ＰＣＲ的模板進(jìn)行擴(kuò)增，使得不同實驗之間具有連續(xù)性，也讓學(xué)生更深入地理解基因工程的實驗設(shè)計及原理。實驗原理基因組ＤＮＡ位于細(xì)胞核內(nèi)，獲取基因組ＤＮＡ首先要將細(xì)胞破碎從而釋放基因組ＤＮＡ。破碎細(xì)胞常用的方法是通過加入含有ＳＤＳ或ＣＴＡＢ等化學(xué)試劑的研磨液進(jìn)行研磨或勻漿。另外，液氮冷凍研磨或蛋白酶處理與加入化學(xué)試劑研磨液的聯(lián)合使用更有利于細(xì)胞破碎基因組ＤＮＡ易溶于２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，不溶于酒精。因此可以利用酒精將ＤＮＡ以沉淀的方式析出再用２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液溶解ＤＮＡ沉淀從而獲得基因組ＤＮＡ溶液。ＤＮＡ在加熱條件下與二苯胺試劑反應(yīng)可生成藍(lán)色物質(zhì)，可以通過顏色反應(yīng)來確認(rèn)是否成功提取出基因組ＤＮＡ。氯仿／異戊醇可以使蛋白質(zhì)變性，有助于去除蛋白質(zhì)，從而純化ＤＮＡ粗提液。ＤＮＡ在波長為２６０ｎｍ處有最大吸收值，蛋白質(zhì)在２８０ｎｍ處有最大吸收峰，鹽和有機(jī)小分子在２３０ｎｍ處有最大吸收峰。純的ＤＮＡ其１．７＜ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＜１．９，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＞２．０。若ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＜１．７表示存在蛋白質(zhì)污染，＞１．９則表示存在ＲＮＡ污染。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＜２．０說明存在鹽等小分子污染。實驗試劑與方法實驗試劑：研磨液，９５％乙醇，氯仿∶異戊醇（２４∶１），３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ，２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，１．５％二苯胺試劑。實驗方法：以新鮮菜花作為實驗材料。１．ＤＮＡ粗提?。悍Q?。矗绮嘶ńM織置于研缽中，加入７ｍＬ研磨液進(jìn)行勻漿，勻漿至沒有大的組織塊，緩慢地將勻漿液轉(zhuǎn)移到１０ｍＬ離心管中，于１２０００ｒｐｍ離心１ｍｉｎ。轉(zhuǎn)移上述上清液至新的離心管中，加入２倍體積９５％乙醇，上下顛倒數(shù)次，可見白色ＤＮＡ絮狀沉淀。用玻璃棒同方向攪拌將ＤＮＡ絮狀物挑出，置于濾紙上吸干多余液體，再轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入２ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液，上下顛倒或緩慢吸打，直至ＤＮＡ絮狀物完全溶解，得到ＤＮＡ粗提液。２．ＤＮＡ的鑒定：吸取１．５ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液作為實驗對照，吸?。保担恚躺鲜觯模危链痔嵋鹤鳛閷嶒灲M。分別在對照組和實驗組中加入３ｍＬ二苯胺試劑，混合均勻后，于沸水浴加熱５ｍｉｎ，觀察并比較兩者顏色的變化。３．ＤＮＡ的純化：從剩余的ＤＮＡ粗提液中吸出２０μＬ備用，作為未純化的基因組ＤＮＡ對照。向剩余的ＤＮＡ粗提液中加入５００μＬ氯仿∶異戊醇（２４∶１），上下顛倒混勻２ｍｉｎ，１２０００ｒｐｍ離心１０ｍｉｎ。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入１／１０體積的３ｍｏｌ／ＬＮａＡＣ，輕柔顛倒混勻，再加入２倍體積的９５％乙醇，輕柔顛倒混勻后，１２０００ｒｐｍ離心５ｍｉｎ，管底的沉淀即基因組ＤＮＡ。緩緩倒掉上清液，室溫待沉淀晾干后，加入１００μＬ２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液溶解ＤＮＡ沉淀，最終獲得純化的基因組ＤＮＡ。分別取２μＬ未純化和純化后的基因組ＤＮＡ溶液，利用超微量紫外可見分光光度計測定ＤＮＡ的純度。結(jié)果與分析１．ＤＮＡ粗提液的二苯胺鑒定：在獲得的１．５ｍＬ菜花組織ＤＮＡ粗提液中加入３ｍＬ１．５％的二苯胺試劑，沸水浴加熱５ｍｉｎ。結(jié)果顯示，與對照組（ＮａＣｌ溶液＋二苯胺試劑）相比，ＤＮＡ粗提液呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色（圖１），說明本次實驗成功將基因組ＤＮＡ提取出來，且ＤＮＡ量較多，足以進(jìn)行二苯胺顏色反應(yīng)，可以肉眼觀察到明顯的顏色差異。２．不同破碎方法對ＤＮＡ粗提取的影響：為了獲得盡量多的組織研磨液，結(jié)合目前組織研磨常用的方法，分別采用破壁機(jī)電動勻漿、采用玻璃勻漿器和研缽手動勻漿。其中研缽研磨分為添加液氮研磨和不添加液氮研磨兩種方式，比較以上４種研磨方法對ＤＮＡ粗提取效果的影響。結(jié)果顯示，利用破壁機(jī)電動勻漿進(jìn)行組織破碎，在破碎過程中會產(chǎn)生大量泡沫影響破碎過程，且破碎過程中會產(chǎn)生熱量，導(dǎo)致ＤＮＡ斷裂，呈現(xiàn)均勻的短片段，無法通過玻璃棒攪拌將ＤＮＡ絮狀物取出。這種現(xiàn)象同樣也出現(xiàn)在使用研缽研磨并且添加液氮的方法中。液氮研磨可以通過制造低溫保證ＤＮＡ不被胞內(nèi)核酸酶降解，但是當(dāng)加入液氮進(jìn)行研磨后，在上清液中加入２倍體積的乙醇后ＤＮＡ不能形成絮狀物，而是呈現(xiàn)均勻分布的小片段，不利于后續(xù)用玻璃棒攪拌獲?。模危恋牟僮鳌Ｅc上述兩種方法相比較，使用玻璃勻漿器和研缽研磨得到的組織破碎液，加入乙醇后能夠肉眼看到大量白色ＤＮＡ絮狀物，可以用玻璃棒通過攪拌的方式將ＤＮＡ絮狀物取出。由于ＤＮＡ的二苯胺顏色反應(yīng)中，需要有足夠多的ＤＮＡ，因此需要較多的植物組織。利用玻璃勻漿器研磨，因其空間較小，且玻璃易碎，研磨量大的組織費時費力，所以利用研缽更有利于大量植物組織的研磨。３．ＤＮＡ粗提液經(jīng)純化后的純度變化：由于ＤＮＡ粗提液中仍然含有大量的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)等，純度太低，導(dǎo)致ＤＮＡ粗提取過程中出現(xiàn)ＤＮＡ沉淀不易溶解的問題，且純度低的基因組ＤＮＡ無法用于基因工程中的相關(guān)酶促反應(yīng)，如ＰＣＲ等。利用氯仿／異戊醇將獲得的ＤＮＡ粗提液進(jìn)行純化，利用超微量紫外可見分光光度計對未純化和純化的基因組ＤＮＡ進(jìn)行純度檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未純化的基因組ＤＮＡ其ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．２３，比值遠(yuǎn)小于１．８，說明該ＤＮＡ粗提液中含有蛋白質(zhì)污染。ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＝１．１９，比值遠(yuǎn)小于２．０，說明該ＤＮＡ粗提液中可能含有小分子有機(jī)物的污染（表１）。而純化后的基因組ＤＮＡＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１．８７，ＯＤ２６０／ＯＤ２３０＝２．０６，說明ＤＮＡ純度較高，基本不含蛋白質(zhì)和小分子的污染（表１）。在ＤＮＡ粗提取實驗中，最關(guān)鍵的一步就是破碎細(xì)胞使得基因組ＤＮＡ得到釋放。另外，本實驗采用二苯胺試劑進(jìn)行ＤＮＡ的鑒定，ＤＮＡ在４０—４００μｇ范圍內(nèi)，與二苯胺試劑反應(yīng)生成的藍(lán)色物質(zhì)吸光度與ＤＮＡ濃度呈線性關(guān)系。如果ＤＮＡ含量太低則二苯胺顯色反應(yīng)無法得到預(yù)期的結(jié)果。想要達(dá)到肉眼明顯可見的藍(lán)色，提取的ＤＮＡ含量需達(dá)到每毫升百微克，這就在破碎細(xì)胞提?。模危?xí)r需要較多的植物組織。這樣就帶來一定的問題：①研磨費時費力，