飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的測(cè)定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 征求意見(jiàn)稿

1GB/T21108－202×飼料中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件描述了飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的測(cè)定。本文件氯霉素的檢出限為1μg/kg、定量限為2.0μg/kg，甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限為5μg/kg、定量限為10μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理試樣中的待測(cè)物在堿性條件下用乙酸乙酯提取、正己烷脫脂，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.1水：GB/T6682，一級(jí)。5.2甲醇：色譜純。5.3氨水。5.4乙酸乙酯。5.5正己烷。5.6水飽和正己烷：在正己烷（5.5）加入水（5.1），搖動(dòng)數(shù)次，靜置分層后取上層使用。5.7標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1mg/mL）：稱取氯霉素（CAS：56-75-7，純度不低于98%）、甲砜2GB/T21108－202×霉素（CAS：15318-45-3，純度不低于98%）和氟苯尼考（CAS：73231-34-2，純度不低于98%）標(biāo)準(zhǔn)品各10mg（精確至0.01mg），分別置于10mL容量瓶中，用甲醇（5.2）溶解、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期6個(gè)月。或購(gòu)買有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。5.8混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10μg/mL）：分別準(zhǔn)確移取氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.7）各1mL于10mL容量瓶中，用甲醇（5.2）稀釋、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期3個(gè)月。5.9混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1μg/mL）：準(zhǔn)確移取1mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（5.8）于10mL容量瓶中，用甲醇（5.2）稀釋、定容，混勻，有效期1個(gè)月。5.10內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1mg/mL）：稱取氘代氯霉素(d5-氯霉素)（純度不低于98%）、氘代甲砜霉素(d3-甲砜霉素)（純度不低于98%）和氘代氟苯尼考(d3-氟苯尼考)（純度不低于98%）標(biāo)準(zhǔn)品各10mg（精確至0.01mg）于10mL容量瓶中，用甲醇（5.2）溶解、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期6個(gè)月?；蛸?gòu)買有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。5.11內(nèi)標(biāo)中間溶液（10μg/mL準(zhǔn)確移取1mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5.10）于10mL容量瓶中，用甲醇（5.2）稀釋、定容，混勻。－18℃以下貯存，有效期3個(gè)月。5.12內(nèi)標(biāo)工作溶液（1μg/mL準(zhǔn)確移取1mL內(nèi)標(biāo)中間溶液（5.11）于10mL容量瓶中，用甲醇（5.2）稀釋、定容，混勻，有效期1個(gè)月。5.13混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.9）及內(nèi)標(biāo)工作溶液（5.12）于10mL容量瓶中，用水（5.1）稀釋、定容，混勻，配制成氯霉素質(zhì)量濃度為0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L，甲砜霉素和氟苯尼考質(zhì)量濃度為1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度為25μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用現(xiàn)配。5.14微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)系。6儀器設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。6.2分析天平：精度為0.1mg、0.01mg。6.3渦旋混合器。6.4冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于13000r/min。6.5氮吹儀。7樣品按照GB/T20195規(guī)定制備試樣，至少200g，粉碎使其全部過(guò)0.425mm試驗(yàn)篩，混合均勻，裝入密閉容器中，備用。8試驗(yàn)步驟8.1試樣溶液制備平行做兩份試驗(yàn)。稱取試樣約2g（精確至0.01g），置于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入渦旋混合2min，200r/min水平振蕩提取30min，于4℃下10000r/min離心5min。準(zhǔn)確移3GB/T21108－202×取上層清液10mL，于另一50mL離心管中，50℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入2mL水（5.1）和離心5min，過(guò)微孔濾膜（5.14），濾液待測(cè)。8.2測(cè)定8.2.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a）色譜柱：C18柱，柱長(zhǎng)100mm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑2.6μm，或性能相當(dāng)者；b）柱溫：35℃;c）流速：0.3mL/min；d）進(jìn)樣量：5μL；e）流動(dòng)相：A相為水（5.1），B相為甲醇（5.2），梯度洗脫程序見(jiàn)表1。表1梯度洗脫程序A相，%B相，%0.020203.025755.02575208.0208.2.2質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：a)電離方式：電噴霧電離，負(fù)離子模式（ESI-）；b)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；c)毛細(xì)管電壓：4.0kV；d)離子源溫度：350℃;e)脫溶劑氣溫度：300℃;f)脫溶劑氣流速：7L/min。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及碰撞能量見(jiàn)表2。表2多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）離子對(duì)、碰撞能量參考值4GB/T21108－202×8.2.3混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定在儀器的最佳條件下，分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（5.13）和試樣溶液（8.1）上機(jī)測(cè)定?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和內(nèi)標(biāo)的定量離子色譜圖見(jiàn)附錄A。8.2.4定性在相同試驗(yàn)條件下，試樣溶液中待測(cè)物的保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（濃度相當(dāng)）中待測(cè)物的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在±2.5%之內(nèi)。根據(jù)表2選擇的定性離子對(duì)，比較試樣譜圖中待測(cè)物監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)離子豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中對(duì)應(yīng)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)離子豐度，若偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。表3定性測(cè)定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差8.2.5定量以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)組分的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)組分的質(zhì)量濃度和內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，如超出線性范圍，應(yīng)重新測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中待測(cè)組分質(zhì)量濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度相差不超過(guò)30%。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)wi計(jì)，數(shù)值以微克每千克(μg/kg）表示。多點(diǎn)校準(zhǔn)按公式（1）計(jì)算；單點(diǎn)校準(zhǔn)按公式（2）計(jì)算：wi=………（1）式中：ρ——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中待測(cè)物質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取用乙酸乙酯總體積，單位為毫升（mL）；V3——凈化、氮?dú)獯抵两珊髲?fù)溶試樣溶液定容體積，單位為毫升（mLV2——凈化用試樣提取溶液體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；5GB/T21108－202×1000——換算系數(shù)。wi=……（2）式中：A——試樣溶液待測(cè)物色譜峰面積；Asi——標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積；ρs——標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mLρi——試樣溶液內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mLV1——試樣提取用乙酸乙酯總體積，單位為毫升（mL）；V3——凈化、氮?dú)獯抵两珊髲?fù)溶試樣溶液定容體積，單位為毫升（mLAs——標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)物色譜峰面積；Ai——試樣溶液內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積；ρsi——標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mLV2——凈化用試樣提取溶液體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g1000——換算系數(shù)。測(cè)定結(jié)果以平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位