牛副流感病毒3型診斷技術(shù)規(guī)范

1牛副流感3型診斷技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了牛副流感3型的臨床癥狀、病原分離鑒定、RT-PCR、ELISA等實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)要求。本文件適用于奶牛飼養(yǎng)場(chǎng)（戶）、肉牛飼養(yǎng)場(chǎng)（戶）和動(dòng)物疫病診療單位對(duì)牛副流感病毒3型的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1牛副流感病毒3型Bovineparainfluenzavirustype3,BPIV3牛副流感病毒3型，屬于副黏病毒科，呼吸道病毒屬成員，為有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒。該病毒可引起牛以發(fā)熱、呼吸困難、流漿液性或黏膿性鼻液和咳嗽等呼吸道癥狀為特征的疾病。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）TAE緩沖液：是由三羥甲基氨基甲烷(Trisbase)、乙酸(aceticacid)和乙二胺四乙酸(EDTA)組成的緩沖液FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）5流行病學(xué)牛副流感3型一年四季均發(fā)，以秋冬、初春季多見(jiàn)。各種年齡牛均可感染。6臨床癥狀2病牛以高熱、呼吸困難和咳嗽為臨床特征。7實(shí)驗(yàn)室診斷7.1病毒分離方法7.1.1材料棉簽、胎牛血清（FBS）或新生牛血清（NBS）、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（板）。7.1.2儀器電子天平、研磨儀、低溫高速離心機(jī)、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、冰箱。7.1.3細(xì)胞牛腎細(xì)胞（MDBK）和非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）。7.1.4病料采集7.1.4.1呼吸道拭子用無(wú)菌棉簽采取鼻道分泌物，然后放入含1000IU/ml青霉素和1000μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的凍存管中，編號(hào)，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實(shí)驗(yàn)室。7.1.4.2血清樣品用促凝管采集新鮮血液，靜置分離血清，編號(hào)，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實(shí)驗(yàn)室。7.1.4.3組織樣品剛死亡的牛，采集肺組織樣品，放入離心管，編號(hào)，記錄，2℃~8℃條件下盡快送往實(shí)驗(yàn)室。7.1.5樣品處理7.1.5.1拭子先經(jīng)凍融兩次，擰干棉拭子，將樣品液經(jīng)6000r/min離心10min，使用一次性注射器吸取上清經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?.1.5.2血清將促凝管中靜置分層的血清轉(zhuǎn)移到滅菌離心管，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?.1.5.3組織按照體積比為1:3～1:5加入PBS（pH7.2～7.4使用組織研磨儀制成勻漿液，取懸液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃下保存?zhèn)溆谩?.1.6樣品接種取處理過(guò)的樣品200μl（樣品接種量根據(jù)細(xì)胞數(shù)目調(diào)整）接種到長(zhǎng)滿80%的MDBK細(xì)胞（25cm2培養(yǎng)瓶），37℃吸附30min；加入含2%FBS或NBS的細(xì)胞培養(yǎng)液5ml，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱。37.1.7結(jié)果判定逐日觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)5日后凍融兩次，繼續(xù)盲傳，觀察細(xì)胞病變。BPIV3致細(xì)胞病變特點(diǎn)：細(xì)胞大量脫落、貼壁細(xì)胞變長(zhǎng)聚集形成網(wǎng)狀。盲傳三代后，若出現(xiàn)病變則收獲培養(yǎng)物，經(jīng)反復(fù)凍融，以3000r/min離心10min，取上清傳代擴(kuò)繁病毒并進(jìn)一步鑒定。7.2RT-PCR7.2.1材料移液器及吸頭、無(wú)菌無(wú)酶離心管、PCR管、病毒RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、TAE緩沖液、瓊脂糖、核酸染料、引物（見(jiàn)附錄A）7.2.2儀器PCR儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像儀。7.2.3待檢樣品處理的樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物。7.2.4病毒RNA提取用病毒RNA提取試劑盒對(duì)已處理的待檢樣品、陰性對(duì)照樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品進(jìn)行RNA提取，并使用核酸分析儀對(duì)RNA質(zhì)量及含量進(jìn)行測(cè)定。7.2.5RT-PCR反應(yīng)體系7.2.5.1RT反應(yīng)65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻。在上述Microtube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μl，RNase4.5μl，緩慢混勻。反應(yīng)條件42℃45min，95℃5min后，冰上冷卻。7.2.5.2PCR反應(yīng)25μl體系：Premix溶液12.5μl，上下游引物（見(jiàn)附錄A)各0.5μl，cDNA模板2μl，無(wú)菌無(wú)酶水9.5μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min,95℃30s，50℃30s，72℃60s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。7.2.6結(jié)果判定取PCR產(chǎn)物10μl，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓100V，時(shí)間30min，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照樣品無(wú)擴(kuò)增帶出現(xiàn)時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶為牛副流感病毒陽(yáng)性，否則為陰性。7.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)7.3.1材料4牛副流感病毒3型重組N蛋白、陰性血清對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG、抗原包被緩沖液（見(jiàn)附錄B.1）、洗滌液（見(jiàn)附錄B.2）、封閉液（見(jiàn)附錄B.3）、TMB底物顯色試劑盒和終止液（見(jiàn)附錄B.4）。7.3.2儀器設(shè)備酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀，移液器及吸頭。7.3.3操作方法7.3.3.1抗原包被BPIV3重組N蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為0.05μg/ml包被反應(yīng)板，每孔100μl，4℃包被16h。7.3.3.2洗板甩掉孔內(nèi)的包被液，洗滌液洗滌三次，200μl/孔。7.3.3.3封閉每孔加封閉液，200μl/孔，置37℃封閉1h,洗滌三次。7.3.3.4加樣標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清和被檢血清均用封閉液作100倍稀釋，每份被檢血清加2孔，每孔100μl，每塊板均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清及稀釋液對(duì)照各2孔。加樣完畢后封板，放37℃孵育1h，洗滌三次。7.3.3.5加酶標(biāo)抗體每孔加入用封閉液稀釋至工作濃度的酶標(biāo)記抗體100μl，置37℃再孵育1h，洗滌三次。7.3.3.6加底物溶液加入顯色底物(TMB)溶液100μl/孔，置37℃避光反應(yīng)15min。7.3.3.7終止反應(yīng)加入終止液50μl/孔,混勻后即刻測(cè)量OD450值。7.3.4結(jié)果判定7.3.4.1P/N比法被檢樣品(P)的吸光度值和陰性標(biāo)準(zhǔn)樣品(N)值之比。2.0>P/N>1.50P/N>2.07.3.4.2目視比色法判為陰性判為可疑判為陽(yáng)性被檢血清孔近于或淺于標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔者判為陰性；略深于標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔者判為可疑；明顯深于標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔者判為陽(yáng)性。8綜合判定58.1經(jīng)6判定為疑似BPIV3感染病例，經(jīng)病毒分離培養(yǎng)和PCR方法檢測(cè)出BPIV3，可判為牛副流感3型病毒感染。8.2臨床無(wú)明顯特異癥狀的非免疫動(dòng)物經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)出抗體陽(yáng)性，可判為該動(dòng)物曾感染或已感染牛副流感3型病毒，需結(jié)合其他方法進(jìn)行綜合確診。6（資料性）A.1引物序列產(chǎn)物大小上游引物CATTGAATTCATACTCAGCAC400bp下游引物AGATTGTCGCATTT(AG)CCTCA.2引物溶解上下游引物用無(wú)菌的DEPC處理水配制成10μmol/L。（資料性）試劑的配制B.1抗原包被緩沖液（0.05mol/lpH9.6碳酸鹽緩沖液）碳酸鈉碳酸氫鈉去離子水0.318g0.588g200ml