支原體“現(xiàn)形記”：培養(yǎng)、指示、PCR

支原體“現(xiàn)形記”：培養(yǎng)、指示、PCR支原體，細胞培養(yǎng)人員的夢魘，堪稱細胞培養(yǎng)界的“隱形殺手”。支原體就像慢性毒藥一樣，殺細胞于無形之中。經常悄然潛入細胞培養(yǎng)體系，無聲無息的毀掉細胞。除了經驗豐富的實驗室老手，一般人難以察覺支原體污染?？蒲蟹矫?，Nature、Cell等期刊高度重視細胞培養(yǎng)實驗中的支原體檢測信息。目前許多國家有相關的法規(guī)，確保源于細胞培養(yǎng)的產品無支原體污染。因此，支原體檢測作為生物制品開發(fā)生產的重要質控指標，貫穿原材料、細胞庫、病毒種子庫、終產品等過程。接下來，我們將全方位歸納支原體污染的知識點，并揭開其神秘面紗，以便我們及時識別和處理支原體污染。防不勝防的支原體支原體（Mycoplasma）是目前發(fā)現(xiàn)是最小原核生物，大小為0.1-0.3μm，可以在過濾膜（0.22-0.45μm）自由穿梭，即常規(guī)過濾除菌對其無效。支原體無細胞壁，造成大多數抗生素對其無效?？股氐闹饕饔脵C制之一：抑制細胞壁合成。支原體細胞形態(tài)存在差異，有球形、桿狀、拉絲、分支等。常規(guī)顯微鏡難觀察到支原體的蹤跡和內部結構，電子顯微鏡能觀測到。細胞培養(yǎng)上清液中的支原體污染（A.支原體模式圖；B.熒光顯微鏡下被污染的大鼠細胞，箭頭所示為支原體。源自參考文獻：doi:10.3390/cells12050682）支原體種類繁多，已超過180種，其中20多種能夠污染體外培養(yǎng)的細胞。但據統(tǒng)計實驗室95%以上的支原體來自這6種：人源的口腔支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體，牛源的萊氏無膽甾原體和精氨酸支原體，以及豬源的豬鼻支原體。支原體不能被革蘭氏染色，可在瓊脂平板上形成“菌落”，并被甲基藍染色。支原體在瓊脂平板形成的“煎蛋菌落”（源自參考文獻：doi:10.1038/nprot.2010.43）支原體分布廣泛，附著在器皿表面，不需要寄生，在無生命的培養(yǎng)基中“自由”生長繁殖，因此防不勝防。支原體污染的嚴重性支原體污染隱蔽性強。污染初期支原體與細胞共存，培養(yǎng)的細胞狀態(tài)沒有明顯變化，死亡率也不會增加，培養(yǎng)基不發(fā)生渾濁。等發(fā)現(xiàn)異常時，可能已經多次傳代，難分清是在哪一代出現(xiàn)的污染。導致無法根治，只能從頭再來。支原體污染影響實驗結果。支原體抑制細胞生長，導致染色體畸變，細胞抗原性改變，復蘇后存活率降低等。支原體污染還會影響細胞代謝和功能，造成細胞蛋白質、DNA、mRNA等合成障礙。支原體（橙色）可以包圍并感染細胞并使基因表達研究的結果無效（源自參考文獻：doi:10.1038/511518a）支原體污染增加成本。發(fā)現(xiàn)不及時往往意味著大量時間、精力和金錢的浪費，尤其是對于生物制藥企業(yè)來說更是后果嚴重。支原體污染可能造成生物制品產量降低、品質下降，甚至整批產品都需丟棄，生產車間也需停產整頓。細胞庫支原體檢測是生物制品工藝流程的重中之重。企業(yè)在細胞庫進入GMP車間前，應做好細胞庫支原體和病毒檢定，生產過程中完成對細胞收獲液的檢定。細胞庫一旦發(fā)生支原體污染，需要開展相應調查，對所有可能風險區(qū)域進行清潔，并制定相應預防措施，相應區(qū)域無法開展生產工作。因此從細胞株構建開始，就應做好支原體檢測，從源頭杜絕污染。如何檢測支原體細胞培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)細胞生長變緩、狀態(tài)變瘦、細胞黏連、出現(xiàn)拉絲鋪展等情況時，可能存在支原體污染。支原體污染可能來自操作人員和細胞培養(yǎng)用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能來自于本身已被污染的細胞系和毒種。支原體污染檢測技術常用的有：1.直接培養(yǎng)法：將待測樣品涂布在支原體固體培養(yǎng)基上，陽性會出現(xiàn)“煎蛋菌落”；2.指示細胞法：DNA熒光染色檢測法：污染的細胞染色后會看到細胞周圍有熒光小點或絲狀物；3.核酸檢測法（NAT）：常規(guī)PCR、qPCR，根據支原體基因組內的保守序列設計特異引物，對待檢樣品的核酸進行擴增。檢測方法優(yōu)勢劣勢直接培養(yǎng)法靈敏度高，可達1-10CFU/mL支原體·

培養(yǎng)期長達28天·

存在漏檢風險指示細胞法·

比培養(yǎng)法快

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成本低·

靈敏度較低·

不適宜檢測粘附較差的口腔支原體和精氨酸支原體核酸檢測法（NAT）·

便捷快速

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通量高·

靈敏度高

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特異性好·

對樣本制備和DNA提取質量依賴性大·

需驗證與培養(yǎng)法和指示細胞法的可比性?義翹神州支原體檢測解決方案1、支原體qPCR檢測試劑盒義翹神州支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）（貨號：MYC01），基于NAT原理，采用FAM、VIC兩種熒光探針，分別檢測目標序列和內參，可覆蓋169種支原體DNA序列。經專屬性、檢測限、耐用性驗證，已支持多個藥品申報。義翹神州支原體qPCR檢測試劑盒產品特點★操作快速：樣本制備和檢測總時長＜3h，無需苦等28天（直接培養(yǎng)法）★靈敏度高：滿足檢測限要求（10CFU/mL）★專屬性強：驗證多個親緣物種、常用細胞系和樣本基質，無交叉反應貨號產品名稱特色MYC01支原體qPCR檢測試劑盒(探針法)覆蓋面廣、檢測限滿足要求、耐用性強RDP01磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒配套使用，節(jié)約時間和成本產品驗證數據展示專屬性：驗證充分?覆蓋全面：可檢測至少169種（120種支原體，9種脲原體、33種螺原體、7種無膽甾原體），覆蓋各國藥典要求的10種支原體。?無樣本基質干擾：9種樣品基質，1種細胞制劑凍存液，均未檢出支原體?無交叉：16種非柔膜菌綱菌株、12種工程細胞、2種哺乳動物細胞（豬、鼠）。檢測限：滿足要求?口腔支原體10CFU/mL樣品的三次檢測，8個重復：24個陽性（檢測陽性率100%）耐用性：?20次凍融，37℃加速長達30天，性能不受影響2、專業(yè)的支原體檢測服務義翹神州建立了北京和蘇州雙檢測中心，通過CMA和CNAS認證，生物安全二級實驗室完全按照GxP質量體系管理，配套透射電鏡、共聚焦顯微鏡、熒光定量PCR儀等先進儀器設備。義翹神州可依據藥典方法及ICH、FDA及其它監(jiān)管法規(guī)，為客戶提供最佳的檢測方案。出具的中英檢測報告獲得NMPA、FDA等監(jiān)管部門認可，已助力多家知名公司完成IND和BLA申報。服務類型周期支原體檢測（培養(yǎng)法）6-8周支原體檢測（DNA染色法）6-8周支原體檢測（qPCR法）1-2周支原體檢測方法學驗證2-3月相關案例數據分享>支原體檢測服務（培養(yǎng)法）義翹神州提供符合法規(guī)要求的支原體檢測服務（培養(yǎng)法），靈敏度符合中國藥典要求，肺炎支原體達到10-9，口腔支原體達到10-5。>支原體檢測服務（DNA染色法）義翹神州提供符合法規(guī)要求的指示細胞培養(yǎng)法（DNA染色法），如果樣品被支原體污染，在熒光顯微鏡下除細胞外，可見大小不等、不規(guī)則的熒光著色顆粒?！緟⒖嘉墨I】1，Weiskirchen,etal.ABeginner’sGuidetoCellCulture:PracticalAdviceforPreventingNeedlessProblems.Cells2023./10.3390/cells120506822，Young,etal.DetectionofMy