實(shí)驗(yàn)四染色質(zhì)

實(shí)驗(yàn)四X染色質(zhì)染色、人類染色體G顯帶標(biāo)本的制備及觀察

指導(dǎo)教師：張鋒滕蕾一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、X染色質(zhì)的標(biāo)本制作。2、觀察X染色質(zhì)，了解其形態(tài)特點(diǎn)。3、了解人體染色體G顯帶技術(shù)方法及各號(hào)染色體G帶帶型。二、實(shí)驗(yàn)原理在間期，女性體細(xì)胞中兩條X染色體中的一條異染色質(zhì)化，約1微米大小呈異固縮狀態(tài)貼近體細(xì)胞核膜內(nèi)緣的濃染小體。用硫堇染色法可使其著色。在口腔粘膜上皮細(xì)胞、羊水脫落細(xì)胞、以及皮膚結(jié)締組織、宮頸、陰道、尿道等組織的間期細(xì)胞核內(nèi)均可檢出X染色質(zhì)。通過檢查，可以判定被檢者的性別，臨床上可用于產(chǎn)前預(yù)測(cè)胎兒性別。三、實(shí)驗(yàn)方法1、取材先讓受檢者用水嗽洗口腔數(shù)次，以盡量除去口腔內(nèi)細(xì)菌或其它雜物。操作者一手拉住受檢查的下唇，一手用牙簽鈍頭部或木質(zhì)（或金屬）壓舌板刮取其粘膜部，棄去第一次刮到的細(xì)胞。在同一部位連續(xù)刮取數(shù)次。（一）X染色質(zhì)染色2、標(biāo)本的制作將刮取物涂在載玻片上，晾干。3、Giemsa染色法置入固定液(甲醇：冰醋酸3:1)中10min。晾干，置入5mol/LHCl中，室溫下水解20min。用自來水中沖洗1min，以充分洗去HCl，以免影響染色液的pH。（這步很關(guān)鍵！）Giemsa染液（現(xiàn)用現(xiàn)配）中染色約4-5min。(Giemsa原液：磷酸鹽緩沖液=1:9)4、X染色質(zhì)觀察先在低倍鏡下找到細(xì)胞較集中而又均勻分散的細(xì)胞群。油鏡下，X染色質(zhì)是位于核膜內(nèi)側(cè)緣輪廓清楚的濃染小體。其直徑約1μm～1.5μm。一般呈平凸、圓開、扁平形或三角形。計(jì)數(shù)50～100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)X染色質(zhì)的陽(yáng)性率。正常值：男性，低于1%；女性，高于10%注意事項(xiàng)避開含有大量細(xì)菌的區(qū)域，因?yàn)橛袝r(shí)這些細(xì)菌會(huì)干擾X的觀察。避免與核內(nèi)其它核質(zhì)凝集物等混淆。凡位于核中間的濃染小體都不在計(jì)數(shù)之內(nèi)?？捎?jì)數(shù)的細(xì)胞，核必須完整，無缺損，無皺褶，核染色均勻。按上述標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)50～100個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)性染色質(zhì)的陽(yáng)性率。（二）人類染色體G顯帶標(biāo)本的制備及觀察1.原理G顯帶是以Giemsa染料染色后，使染色體顯帶的技術(shù)。Giemsa染料是由噻嗪和曙紅組成的，著色時(shí)DNA可與之結(jié)合，形成沉淀物，而DNA的某些部位對(duì)染料不敏感，由此形成明暗相間的條帶。

G顯帶的方法很多，最常用的是將已固定的染色體制片進(jìn)行預(yù)處理，再用Giemsa染色。預(yù)處理的方法非常多，可用熱、堿、各種蛋白酶、尿素等，其中最常用的是胰蛋白酶進(jìn)行預(yù)處理。2、制片烤片：常規(guī)法制作染色體標(biāo)本，置60℃烘箱烘8h～10h，然后置37℃烘箱烘3d左右預(yù)處理：將經(jīng)過烘烤的片子投入0.02%胰蛋白酶溶液中，并不斷擺動(dòng)，2.5min左右，自來水沖洗。染色：Giemsa染液染色8～10min，水沖洗。鏡檢：空氣干燥、鏡檢。3、實(shí)驗(yàn)觀察低倍觀察：先在低倍鏡自上而下，自左至右地選擇合適的、帶紋清晰的G帶中期分裂相油鏡觀察：轉(zhuǎn)至油鏡下觀察，根據(jù)每號(hào)染色體的特征予以鑒別。正常女性G顯帶染色體的核型分析（46，XX）注意事項(xiàng)制片：G顯帶的好壞，首先取決于染色體本身制片的質(zhì)量，染色體要較長(zhǎng)，以早中期為宜，且中期相豐富、分散好，無胞漿背景。標(biāo)本保存時(shí)間：不宜太長(zhǎng)。時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)胰酶處理的抵抗性越強(qiáng)，片齡過長(zhǎng)的標(biāo)本染色后會(huì)導(dǎo)致斑點(diǎn)狀而非帶紋。胰酶溫