微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)乳酸菌的分離與純化

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)乳酸菌的分離與純化三、實(shí)驗(yàn)器材:菌種來(lái)源:市場(chǎng)銷(xiāo)售得各種新鮮酸乳培養(yǎng)基:BGC牛乳培養(yǎng)基乳酸菌培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基糖發(fā)酵培養(yǎng)基BGC牛乳培養(yǎng)基(A)溶液:脫脂乳粉100g,水500mL,加入1、6%溴甲酚綠(B、G、C)乙醇溶液1mL,80℃滅菌20min。(B)溶液:酵母膏10g,水500mL,瓊脂20g,pH6、8,121℃滅菌20min。以無(wú)菌操作趁熱將(A)、(B)溶液混合均勻后倒平板。乳酸菌培養(yǎng)基牛肉膏5g,酵母膏5g,蛋白胨10g,葡萄糖10g,乳糖5g,氯化鈉5g,水1000mL,pH:6、8;1、6%溴甲酚綠蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨10g,氯化鈉5g,水1000mL,pH:7、2~7、4糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基1000mL,1、6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL,pH:7、6,另配20%糖溶液(葡萄糖,蔗糖)各10mL。制法:1)將上述含指示劑得蛋白胨水培養(yǎng)基(pH:7、6)分裝于試管中,在每管內(nèi)放一倒置得小玻璃管。2)將已分裝好得蛋白胨水培養(yǎng)基和20%得各種糖溶液分別滅菌,蛋白胨水培養(yǎng)基121℃滅菌20min,糖溶液112℃滅菌30min。3)滅菌后,每管以無(wú)菌操作分別加入20%得糖溶液0、5mL,則成1%得濃度。有關(guān)溶液:1、6%溴甲酚紫乙醇溶液:溴甲酚紫1、6g溶于100mL乙醇中,貯存于棕色瓶中保存?zhèn)溆?。吲哚試?對(duì)二甲基氨基苯甲醛8g,95%乙醇760mL,濃鹽酸160mL。10%硫酸2%高錳酸鉀含氨得硝酸鹽溶液:稱(chēng)取硝酸銀2g,蒸餾水100mL,待硝酸銀溶解后,取出10mL備用,向其余得90mL硝酸銀中滴加氨水,即可形成很厚得沉淀,繼續(xù)滴加氨水至沉淀剛剛?cè)芙獬蔀槌吻迦芤簽橹?再將備用得硝酸銀慢慢滴入,則溶液出現(xiàn)薄霧,但輕輕搖動(dòng)后,薄霧狀得沉淀又消失,繼續(xù)滴入硝酸銀,直到搖動(dòng)后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定得薄霧狀沉淀為止。10大家應(yīng)該也有點(diǎn)累了，稍作休息大家有疑問(wèn)的，可以詢(xún)問(wèn)和交流四、操作步驟:(一)乳酸菌得分離純化

1、稀釋分離培養(yǎng)基得配制滅菌倒平板制備樣品稀釋液接種(涂布法)培養(yǎng)每組準(zhǔn)備下列器材(滅菌)

1、培養(yǎng)基A溶液(250ml三角瓶,內(nèi)裝125ml)2、培養(yǎng)基B溶液(250ml三角瓶,內(nèi)裝125ml)3、試管7支(內(nèi)裝9ml水)4、培養(yǎng)皿一包(9個(gè))5、1ml刻度吸管7支

1mL瓊脂培養(yǎng)基每管各9mL無(wú)菌水

取市售新鮮酸乳稀釋至10-6,取其中得10-4、10-5、

10-63個(gè)稀釋度得稀釋液各0、2mL,分別接入BGC牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板上,用無(wú)菌玻璃刮刀依次涂布,置40℃培養(yǎng)48h,如出現(xiàn)圓形稍扁平得黃色菌落及其周?chē)囵B(yǎng)基變黃者初步定為乳酸菌。2、劃線(xiàn)分離挑取單菌落平板劃線(xiàn),置40℃培養(yǎng)48h。挑選出乳酸菌進(jìn)行連續(xù)6次以上得傳代,以達(dá)到提純。(二)鑒別1吲哚試驗(yàn)1)試管標(biāo)記:取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基得試管n+1支,分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2)接種培養(yǎng):以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔到標(biāo)記乳酸菌得試管中,標(biāo)記有空白對(duì)照得不接種,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。3)觀(guān)察記錄:在培養(yǎng)基中加入乙醚1~2mL,經(jīng)充分振蕩,使吲哚萃取至乙醚中,靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液得上面,此時(shí)沿管壁緩慢加入5~10滴吲哚試劑,如有吲哚存在,乙醚層呈玫瑰色,此為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng),否則為陰性反應(yīng)。2、糖發(fā)酵試驗(yàn)1)試管標(biāo)記:取分別裝有葡萄糖,蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各n+1支,每種糖發(fā)酵試管中分別標(biāo)記乳酸菌和空白對(duì)照。2)接種培養(yǎng):以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中,每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液得空白對(duì)照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液得杜氏小管倒置試管中,置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,觀(guān)察結(jié)果。3)觀(guān)察記錄:與對(duì)照管比較,若接種培養(yǎng)液保持原由顏色,其反映結(jié)果為陰性;如果培養(yǎng)液呈黃色,反映結(jié)果為陽(yáng)性。培養(yǎng)液中得杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng),杜氏小管內(nèi)沒(méi)有氣泡為陰性反應(yīng)。3、乳酸得檢測(cè)選用已經(jīng)分離得菌種做小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn),取發(fā)酵液得上清液約10mL于試管中,加入10%硫酸1mL,再加2%高錳酸鉀1mL,此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛,把事先在含氨得硝酸銀溶液中侵泡得濾紙條搭在試管口中,微火加熱試管至沸,觀(guān)察濾紙變化。五、結(jié)果分析1、乳酸菌得分離提純?cè)谄桨迳铣霈F(xiàn)了圓形稍扁平得黃色菌落,周?chē)囵B(yǎng)基變?yōu)辄S色,初步定為乳酸菌⑴,取出少量在顯微鏡下觀(guān)察到了鏈球狀和桿狀兩種形狀。2、乳酸菌得鑒定該菌種得菌落為圓形稍扁平得黃色菌落,有桿狀和鏈球狀兩種形狀。在吲哚試驗(yàn)中,加入菌種得試管無(wú)任何變化,證明為陰性反應(yīng)說(shuō)明該菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚得能力。也說(shuō)明