生物化學(xué)：核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

第14章核酸物理化學(xué)性質(zhì)NucleicAcid一、核酸的水解

酸、堿、酶水解作用于磷酸二酯鍵和糖苷鍵DNA/RNA對酸/堿的耐受程度有差別二、核酸的酸堿性質(zhì)具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)能發(fā)生酮式/烯醇式、氨式/亞氨式互變嘌呤和嘧啶堿基都具有弱堿性

______主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻(xiàn)1、堿基的解離

胞嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中鳥嘌呤和次黃嘌呤中質(zhì)子則結(jié)合到N7上2、核苷的解離戊糖可增強(qiáng)堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離3.核苷酸的解離磷酸基使核苷酸具有很強(qiáng)的酸性DNA等電點(diǎn)為4～4.5；RNA等電點(diǎn)為2～2.5三、核酸的紫外吸收

堿基含有共軛雙鍵最大吸收峰260nm左右核酸溶液紫外吸收以摩爾磷的吸光度表示，摩爾磷即相當(dāng)于摩爾核苷酸。ε：摩爾吸光系數(shù)

A：吸收值

W：每升溶液磷重量

L：比色杯內(nèi)徑OD260的應(yīng)用：1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0含雜蛋白及苯酚，降低3.判斷DNA是否變性四、核酸的變性、復(fù)性與雜交(一)核酸的變性（denaturation）

1、DNA的變性：

在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。

某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。

不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變2、變性的實(shí)質(zhì)降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂

高溫（一般＞75℃）—

熱變性

強(qiáng)酸、堿

—

酸堿變性

甲醛（Agarose中RNA）

尿素（PAGE中DNA）3、變性因素

OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失4、變性后理化性質(zhì)變化RNA變性：從螺旋到線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒有DNA明顯完全變性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA25－40%、RNA約1.1%實(shí)質(zhì)：堿基暴露由于變性或降解引起紫外吸收增加的現(xiàn)象稱增色效應(yīng)DNA變性5、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變解鏈曲線：連續(xù)加熱DNA，以溫度對A260作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。指增色效應(yīng)達(dá)50%時(shí)的溫度一般DNATm值在85-90

C之間Tm：DNA變性時(shí)，OD260達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度(Tm)。大小與G+C含量成正比。（1）DNA的均一性：（2）G－C含量：

經(jīng)驗(yàn)公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：

Tm值大小與下列因素有關(guān)：(二)核酸的復(fù)性（renaturation）變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈重新締合成雙鏈——復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。DNA復(fù)性分子量越大復(fù)性越難；濃度越大，復(fù)性越容易；DNA復(fù)性也與它本身組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)（具有很多重復(fù)序列DNA，復(fù)性快）。減色效應(yīng)（低色效應(yīng)）——復(fù)性時(shí)紫外吸收減少的現(xiàn)象(三)核