自動生化分析儀分析技術

自動生化分析儀分析技術目前絕大部分臨床生物化學檢驗項目已實現(xiàn)自動化其中大多數(shù)由自動生化分析儀完成該儀器以紫外－可見光分光光度法為主要檢測原理目前較多大型儀器也組合了離子選擇電極模塊利用散射比濁、電化學、電泳和色譜等技術得檢測項目,由其她相應得自動分析儀完成,在第八章中敘述

自動生化分析儀(automaticbiochemicalanalyzer)

提高質(zhì)量和速度減輕勞動強度節(jié)約樣品和試劑有利于標準化

操作步驟程序化電腦控制自動進行取樣、加試劑、混勻保溫反應、吸光度檢測結果計算、可靠性判斷數(shù)據(jù)顯示、打印、傳輸清洗等目錄

自動生化分析儀概述（了解和熟悉）1自動生化分析儀的分析技術（掌握）2自動生化分析儀的操作方法（了解）3自動生化分析儀性能評價（熟悉）4小結與展望5返回總目錄第一節(jié)自動生化分析儀概述

已發(fā)展50多年,可分為:

連續(xù)流動式(continuousflowstyle)

分立式(discretestyle)

離心式(centrifugationstyle)近十余年增加:分析前自動化處理模塊分析后自動化處理模塊分立式(discretestyle):目前最常用干化學(drychemistry)分析系統(tǒng):急診等領域應用普遍

本節(jié)內(nèi)容一、自動生化分析儀得發(fā)展歷史二、分立式自動生化分析儀得分析原理三、干化學分析系統(tǒng)一、自動生化分析儀得發(fā)展歷史(一)連續(xù)流動式自動生化分析儀(二)分立式自動生化分析儀(三)離心式自動生化分析儀(四)自動化樣品前處理系統(tǒng)(五)自動化樣品后處理系統(tǒng)(六)模塊式分析系統(tǒng)(七)全實驗室自動化(一)連續(xù)流動式自動生化分析儀1957年第一臺,Skeggs醫(yī)生提出方案,Technicon公司設計儀器組成:樣品盤:樣品集中放置在能轉(zhuǎn)動得樣品盤上比例泵:將樣品和試劑按比例吸取得裝置透析器:去除蛋白質(zhì),制備無蛋白濾液反應管道:樣品和試劑混合和反應均在其內(nèi)混合器:使管道內(nèi)樣品和試劑混合得裝置恒溫器:能加熱反應,可達90℃檢測器:吸光度測定、光電轉(zhuǎn)換和信號檢測注:1960年代前許多生化測定需采用無蛋白濾液和較高溫度自動稀釋器流動比色杯示意圖連續(xù)流動式自動生化分析儀部件連續(xù)流動式自動生化分析儀特點:樣品與試劑在一條連續(xù)管道內(nèi)進行化學反應并檢測不同樣品間得交叉污染采取空氣隔絕得措施來避免

管道(通道):通常一個管道只能測定一個項目單通道和多通道式:根據(jù)管道數(shù)量而分

通道數(shù):目前在廣義上就是指分析儀能同時測定得項目數(shù)

應用:就是20世紀50~80年代市場占有率最高得儀器

由于通道少、分析速度慢、試劑浪費大,逐漸被淘汰(二)分立式自動生化分析儀第2代自動生化分析儀交叉污染小,形式多樣、靈活已普遍應用

詳見本節(jié)二

大家學習辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜(三)離心式自動生化分析儀第3代分析儀,20世紀70年代初期設計運行特點:樣品和試劑分置于轉(zhuǎn)盤中各自相應得凹槽內(nèi),樣品在外側(cè),試劑在內(nèi)離心使內(nèi)側(cè)試劑受離心力甩向外側(cè)凹槽內(nèi),與樣品相互混合發(fā)生反應一定時間后流入轉(zhuǎn)盤外圈得比色凹槽內(nèi)由光度計檢測缺點:同一個離心盤一般同時分析一個項目反應盤中得凹槽無自動清洗功能分析速度慢應用:20世紀70~80年代在中國非常流行

因其缺點故應用逐漸減少離心式分析儀工作原理離心式分析儀現(xiàn)用于凝血功能指標檢測離心式分析儀轉(zhuǎn)盤加樣針加試劑針能獨立工作

或連接在自動生化分析儀之前

組成:樣品投入部離心分離部開蓋部在線分注部條碼(barcode)生成及粘貼部功能:能避免血清分離、分裝、識別等環(huán)節(jié)得差錯(四)自動化樣品前處理系統(tǒng)收納部離心部開栓部在線分注部非在線分注部貼條碼部閉栓部樣品分注收存部接收部自動化樣品前處理系統(tǒng):樣品投入部離心分離部開蓋部在線分注部條碼部MODULARPRE-ANALYTICSMODULARANALYTICS

模塊組合加前處理Beckman

前處理系統(tǒng)Beckman前處理系統(tǒng)

機械臂開塞(五)自動化樣品后處理系統(tǒng)主要功能:樣品加蓋和低溫儲存組成:關蓋部、樣品分注收存部、樣品接收部

廣義得樣品檢測后處理還包括結果審核、可疑結果復查、結果輸出等實驗室信息系統(tǒng)(laboratoryinformationsystem,LIS)可實現(xiàn)以上功能樣品接收部(六)模塊式分析系統(tǒng)20世紀90年代中期開始推出由相同或不同得兩臺或兩臺以上分析模塊組合連接:

基于光度法分析原理得生化分析模塊基于離子選擇電極原理得電解質(zhì)分析模塊基于免疫發(fā)光分析原理得免疫分析模塊

各分析模塊既有各自控制系統(tǒng)又有共用得控制系統(tǒng)樣品通過傳送帶在各模塊之間進行傳遞模塊式分析系統(tǒng)又稱為組合式自動分析儀模塊式分析系統(tǒng)日立7600全自動生化分析儀自動分析儀樣品傳送軌道(七)全實驗室自動化

(totallaboratoryautomation,TLA)指實驗室得各種操作過程均實現(xiàn)自動化

將各種相關得自動化分析儀器串聯(lián)起來

組合成流水線式得作業(yè),把樣品輸送到不同得檢測單元

并將各個儀器得檢測結果合并輸出組成:樣品前處理系統(tǒng)樣品輸送系統(tǒng)樣品檢測單元不同檢測原理得各檢測單元往往需由同一公司生產(chǎn)以同一標準來連接,通過計算機控制運行血細胞系統(tǒng)凝血系統(tǒng)生化系統(tǒng)免疫系統(tǒng)HitachiTLA東京大學附屬醫(yī)院TLA采血管準備系統(tǒng):病人編號、資料血液凝塊檢測單元可移動機器人連接單元自動平衡離心機樣品性狀檢測－再離心化學－免疫自動化儀器單元尿液分析單元血糖和糖化血紅蛋白檢測單元血細胞計數(shù)單元二、分立式自動生化分析儀得分析原理分立式自動生化分析儀完全模仿手工操作方式設計特點:各檢測項目在各自獨立得反應杯中進行反應杯具有試管功能,同時又兼做比色杯

分立式全自動生化分析儀貝克曼LX20生化分析儀HitachiClinicalChemistryAnalyzer

7600系列雅培Architectc8000分立式分析儀基本結構

(一)樣品盤或樣品架－－－(待測樣品和試管架)(二)試劑室和試劑瓶－－－(試劑架和試劑瓶)(三)反應杯和反應盤－－－(試管和試管架)(四)取樣和加試劑裝置－－(進樣器和刻度吸管)(五)混勻與攪拌裝置－－－(手工混勻和漩渦振蕩器)(六)溫控和定時系統(tǒng)－－－(恒溫水浴和定時鐘)(七)光路和檢測系統(tǒng)－－－(比色計)(八)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)－－－－(計算器或電腦)(九)清洗系統(tǒng)－－－－－－(試管清洗)(一)樣品盤或樣品架(specimendiscorrack

)樣品盤放置樣品杯或不同規(guī)格采血試管得裝置放置樣品數(shù)多,轉(zhuǎn)動后使不同樣品到特定位置進樣樣品盤(俯視圖,日立分析儀)樣品架一臺儀器有許多個,每個放置5或10只樣品杯或試管

經(jīng)傳送帶移動樣品到特定位置進樣樣品架上得條形碼或底部編碼孔

識別樣品架號及樣品位置號有些儀器有專用于

急診樣品、校準品、質(zhì)控品等

得可識別架

OLYMPUS生化分析儀得樣品架空白架校準架質(zhì)控架常規(guī)架貝克曼LX20生化儀樣品架樣品架得優(yōu)點①隨著樣品架移動及樣品得被檢測,可不斷追加已放置樣品杯或采血試管得樣品架②通過樣品架得移動能將樣品傳送到另一個分析模塊甚至另一臺分析儀上再進行分析

OLYMPUS生化儀上等待分析得樣品樣品架及其在軌道中得運行雅培C8000常規(guī)樣品盤位置常規(guī)樣品位和急測樣品位雅培C8000分析儀急測樣品位優(yōu)先順序分別為:機上轉(zhuǎn)盤,急診/優(yōu)先位,常規(guī)位機上轉(zhuǎn)盤急診優(yōu)先位急測樣品位日立7600生化儀條形碼(barcode)

標本條形碼:樣品杯或采血試管上包含樣品信息得條形碼包含信息如編號、患者資料、標本類型、檢測項目等

樣品架條形碼或底部編碼孔試劑瓶條形碼分析儀上能安裝條碼識別器閱讀條碼上信息(二)試劑室(reagentchamber)和試劑瓶試劑室:具有冷藏功能(1)試劑轉(zhuǎn)盤式:放置一定形狀試劑瓶,數(shù)量不等試劑盤轉(zhuǎn)動可使某個試劑瓶到達特定得試劑吸取位置(2)試劑架形式:放置大容量任意形狀得試劑瓶由每個試劑瓶內(nèi)引出一條試劑管路及其噴嘴不同試劑間無交叉污染大型分析儀通常有第一和第二試劑室個別分析儀具有加入第三試劑得功能外圈為第一試劑,內(nèi)圈為第二試劑日立7600生化儀P模塊試劑倉奧林帕斯AU2700試劑倉(蓋子打開后)試劑盤樣品盤加樣機構加試劑機構清洗機構攪拌機構反應盤反應杯日立7170生化儀光學系統(tǒng)壓電攪拌清洗機構

ISE模塊—檢測Na+、K+、Cl-165個反應杯試劑位R1、R2雅培C8000生化儀工作面R1R2(三)反應杯(reactioncuvette)和反應盤反應杯:就是樣品與試劑進行化學反應得場所由透光性好得硬塑料或石英玻璃制成容量160μl～500μl不等,厚度0、5cm～1cm

同時用作比色杯反應盤:由100只或更多得反應杯圍成一圈組成

有些分析儀具有兩圈反應杯

反應盤作恒速圓周運動,轉(zhuǎn)動到某些特定位置時短暫停止,在反應杯中加入樣品、試劑或進行攪拌混勻反應杯與反應盤(一體化)美國TECHNICONRA系例生化儀雙圈比色杯組(分內(nèi)圈和外圈)日立反應杯組AU2700C8000外圈內(nèi)圈(四)取樣和加試劑裝置1、取樣裝置

組成:取樣針、取樣臂、取樣管路、取樣注射器和閥門取樣容量:一般為2μl～35μl,步進0、1μl不等交叉污染:在吸取不同樣品時可產(chǎn)生攜帶交叉污染防止措施:對樣品針內(nèi)外壁進行水沖洗化學惰性液隔絕樣品與取樣針內(nèi)外壁特殊功能:液面感應:取樣針尖上設有電子感應器防撞裝置:遇到阻礙時取樣針立即停止運動并報警阻塞報警:某些取樣針有取樣裝置日立7170生化儀加樣針奧林帕斯AU2700加樣針2、加試劑裝置組成:類似于取樣裝置(多數(shù))取試劑量:一般為20μl～380μl,步進1μl～5μl不等交叉污染:在吸取不同試劑時可產(chǎn)生攜帶交叉污染防止措施:對試劑針內(nèi)外壁進行水沖洗特殊功能:

液面感應防撞裝置預熱試劑第一試劑第二試劑反應盤清洗攪拌加試劑機構加樣品機構奧林帕斯AU2700灌注式加試劑裝置每種試劑單獨使用一條試劑管路和噴嘴優(yōu)點:不存在各試劑間得交叉污染缺點:管路通常較長,試劑死腔較大管路中試劑無低溫保存日立7600生化儀灌注式加試劑裝置反應盤(五)混勻裝置反應杯里得樣品與試劑需要混勻混勻方式:攪拌混勻:用攪拌棒(stirringrod),多數(shù)超聲混勻:可杜絕攜帶污染,極大程度減少泡沬產(chǎn)生攪拌棒混勻攪拌棒形狀:扁平棒狀或扁平螺旋狀,表面疏水材料工作方式:旋轉(zhuǎn)式攪拌震動攪拌防交叉污染:水洗C8000攪拌機構壓電型攪拌奧林帕斯AU2700攪拌機構反應盤反應杯攪拌機構日立7600生化儀D模塊攪拌機構日立7170生化儀攪拌棒試劑針試劑針清洗劑試劑室反應盤(六)溫浴系統(tǒng)反應杯需浸浴在規(guī)定溫度中,溫度波動不能大于±0、1℃

一般固定在37℃溫浴方式:水浴:升溫速度快,溫度穩(wěn)定需加防腐劑保持水潔凈,并要定期更換循環(huán)水空氣浴:受環(huán)境溫度影響較大,保養(yǎng)簡單恒溫液:循環(huán)間接加熱法,兼具有空氣和水浴得優(yōu)點無污染、惰性得不蒸發(fā)液體用很小縫隙得空氣把比色杯與恒溫液隔開(七)光學檢測系統(tǒng)由光源、單色器和信號檢測系統(tǒng)組成單色器:常采用光柵,選擇10～12種固定得單色光

分光方式:

前分光:光源→分光元件→單色光→反應液→檢測器

后分光:光源→反應液→分光元件→單色光→檢測器后分光:分光后取多個固定單色光同時通過各自得信號傳送通路(如光導纖維)傳輸?shù)綄眯盘枡z測器

優(yōu)點:單色器中沒有轉(zhuǎn)動部分,提高了檢測精度和速度日立生化分析儀得可選比色波長:340、405、450、470、505、545、570、600、650、700、750、800nmOLYMPUS生化分析儀得可選比色波長:340、380、410、450、480、520、540、570、600、660、700、750、800nm雅培C8000生化分析儀可選擇波長:340、380、404、412、444、476、500、524、548、572、604、628、660、700、748、804nm信號檢測系統(tǒng)光信號→光敏二極管→電信號→放大電路→模數(shù)轉(zhuǎn)換電路→數(shù)字信號→微處理器按各測定項目得分析參數(shù)選擇其波長得吸光度值可選擇1或2個波長(八)清洗系統(tǒng)樣品針、試劑針和攪拌棒得隨時清洗

在用于下一個樣品、試劑或反應杯前需清洗一次

多數(shù)為去離子水沖洗反應杯得隨時清洗

多數(shù)全自動生化分析儀具有反應杯清洗裝置

一個反應杯內(nèi)得化學反應和吸光度檢測結束后

該反應杯就被沖洗系統(tǒng)及時沖洗

沖洗過程:廢液針吸走杯內(nèi)廢液→加清洗劑洗滌并抽干→數(shù)次去離子水沖洗及抽干→吸光度檢查批檢測完成后得自動清洗通常為清洗劑(detergent)清洗日立7170生化儀樣品針清洗日立7170生化儀攪拌棒試劑針試劑針清洗劑試劑室反應盤試劑針外壁清洗站清洗站反應杯反應盤樣品針反應杯清洗機構日立7600分析儀D模塊樣品杯清洗針示意圖比色杯清洗劑或純水2防溢出3廢液1反應杯清洗機構AU2700(九)計算機控制系統(tǒng)控制樣品測定程序計算測定結果判斷結果準確性顯示和輸出測定結果數(shù)據(jù)儲存等三、干化學分析系統(tǒng)干化學分析技術利用固相試劑(干片試劑)測定方式:在干片試劑上滴加液態(tài)樣品載體上試劑溶解并與與樣品中待測成分發(fā)生反應測定檢測信號得反射光強度“干化學”技術就是相對于經(jīng)典得“濕化學”技術而言實際上就是在一定潮濕狀態(tài)下得化學反應(一)干化學分析儀干化學儀分析儀與配套試劑組成一個檢測系統(tǒng)包括:血糖儀尿液化學分析儀全自動干化學分析儀:急診化驗室常用不同儀器隨試劑檢測原理不同采用不同監(jiān)測器半自動干化學分析儀干化學試劑(正面與反面)(二)干化學試劑片1、反射光度法5層結構目前普遍采用膠片涂層技術制備成得多層膜干試劑片①滲透擴散層:樣品迅速均勻滲透,阻止顆粒成分和蛋白質(zhì)等大分子向下滲透②反射層:白色不透明層,下側(cè)涂布反射系數(shù)>95%得物質(zhì)如BaSO4,能隔離滲透擴散層中有色物質(zhì)③輔助試劑層:去除血清中得內(nèi)源性干擾物,如固定維生素C氧化酶以消除血清中維生素C對H2O2得還原作用④試劑層:即反應層,固定了該檢測項目所需得試劑⑤支持層:透明塑料基片,允許反射光完全透過,而樣品濃度與反射光強度成反比試劑層和支持層之間可加一吸水層加快樣品和試劑得滲透速度基于熒光反射光度法得多層膜根據(jù)免疫競爭反應原理,主要用于半抗原如藥物濃度測定膜結構主要分四層擴散層:含緩沖液、表面活性劑,及固相抗體與熒光標記半抗原結合得復合物,并只允許小分子物質(zhì)如半抗原通過光屏層:含氧化鐵可阻止熒光標記半抗原被激發(fā)信號層:激發(fā)光可作用于反應產(chǎn)物基片層:起支持作用樣品中半抗原進入擴散層,競爭性結合固相抗體,使一部分熒光標記半抗原被置換下來成為游離熒光標記半抗原,并通過光屏層進入信號層;在激發(fā)光得作用下,由于光屏層得阻遏作用,僅信號層得熒光標記半抗原可被激發(fā)產(chǎn)生熒光2、基于差示電位法得多層膜常用于無機離子K+、Na+、Cl-等得檢測5層結構:

離子選擇敏感膜、參比層、氯化銀層、銀層和支持層電極:

樣品電極

參比電極測定方式:取一定量血清加到樣品電極得加樣槽中,再取等量參比液加入?yún)⒈入姌O得加樣槽中,通過電位計來測定這兩個電極得差示電位返回章目錄一、常用分析方法(一)終點法(二)連續(xù)監(jiān)測法二、分析參數(shù)設置(一)基本分析參數(shù)(二)特殊分析參數(shù)(三)分析參數(shù)設置舉例第二節(jié)自動生化分析儀得分析技術

兩類基本分析方法各種分析儀上得一些其她方法,均可歸于這兩類之中如一點終點法、兩點終點法、兩點速率法等任何方法均以一定間隔時間測定化學反應全過程吸光度值一、常用分析方法終點法連續(xù)監(jiān)測法正向反應:吸光度升高負向反應:吸光度下降正向反應負向反應時間-吸光度曲線

吸光度隨時間變化得曲線稱為時間-吸光度曲線

測定吸光度得時間點稱為測光點

用于計算結果得測光點稱為讀數(shù)點

(一)終點法(endassay)概念:被測物在反應過程中被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物后,化學反應達到終點或平衡點,根據(jù)終點吸光度得大小求出被測物濃度,稱為終點法。該法稱為平衡法更為恰當。終點法A變化特點:終點或平衡點吸光度基本不變透射比濁法:抗原和特異性抗體產(chǎn)生濁度反應,濁度具光吸收能力,在生化分析儀中為透射比濁,采用終點法。1、一點終點法(onepointendassay)以時間-吸光度曲線上A基本不再改變時得第33個測光點為讀數(shù)點

計算公式:

Cu=(Au)n×Cs/(As)n

Cu、Cs為待測物和校準液濃度

(Au)n、(As)n為待測物和校準液終點ACs/(As)n為校準K值2、兩點終點法(twopointendassay)在時間-吸光度曲線上選擇兩個讀數(shù)點計算公式:Cu=[(Au)n-a×(Au)m]×校準K值

a為反應液體積校正系數(shù)

a=(Vs+Vr1)/(Vs+Vr1+Vr2)

Vs、Vr1、Vr2分別表示樣品、

第一試劑和第二試劑得體積

目前全自動生化分析儀均具有自動校正反應液體積得功能校準K值=Cs/[(As)n-a×(As)m]兩點終點法與雙試劑法兩點終點法常應用于具有雙試劑得測定項目中雙試劑法:即具有兩種試劑得方法第一試劑通常只含緩沖液等成分,與樣品不起特異性反應因此第二試劑加入前得讀數(shù)點吸光度相當于樣品空白第二試劑與待測物起反應并經(jīng)一定時間反應到達終點終點測光點為第二讀數(shù)點如圖7-2中,第二試劑在第16點和17點之間加入

則通常取第16點Am為第一讀數(shù)點

第33點即最后1個測光點An為第二讀數(shù)點兩點終點法得作用能有效消除樣品造成得光吸收干擾如溶血(hemolysis)、黃疸(icterus)和脂濁(lipo-turbid)等酶法GLU、TC、TG、UA、CR等化學法TP、TB、DB、Ca、Pi、Mg、Fe等且都能在加R2后2～5min內(nèi)達反應終點

故可設定兩點終點法單試劑型得項目只能選擇一點終點法

固定時間法(fixed-timeassay)為終點法中得特殊情況在時間-吸光度曲線上選擇得兩個讀數(shù)點

既非反應初始吸光度亦非終點吸光度,其差值用于結果計算固定時間法可解決某些化學反應得非特異性問題例如:苦味酸法測定肌酐反應最初30s,血清中快反應干擾物(如維生素C、丙酮酸、乙酰乙酸等)能與堿性苦味酸反應在第二個30s,堿性苦味酸主要與肌酐反應

且此段時間－吸光度曲線得線性較好(故也可用連續(xù)監(jiān)測法測定肌酐)在80s～120s及其以后,堿性苦味酸可與蛋白質(zhì)以及其她慢反應干擾物反應

故選用30s～80s這段固定時間為測定時間(二)連續(xù)監(jiān)測法(continuousmonitoringassay)又稱速率法(rateassay)用于酶活性和酶法代謝物測定連續(xù)選取時間-吸光度曲線中線性期內(nèi)>4個測光點為讀數(shù)點

并以其單位時間A值(ΔA/min)計算結果正向連續(xù)監(jiān)測法

負向連續(xù)監(jiān)測法線性期各測光點之間得吸光度差值相等得時期圖中δ2＝δ3＝δ4,而δ1及δ5值偏小,故A1點至A4點為線性段此線性期對酶促反應得底物來說屬零級反應,期間得ΔA/min即為酶促反應得初速度,其大小與被測酶活性成正比連續(xù)監(jiān)測法得優(yōu)點即就是可確定線性期,準確計算酶活性,因而使自動生化分析儀在酶活性測定方面顯著地優(yōu)于手工法連續(xù)監(jiān)測法結果計算公式酶活性(U/L)＝ΔAu/min×K值代謝物濃度Cu=ΔAu/min×校準K值

校準K值=Cs/(ΔAs/min)酶活性測定公式中得K值包括

理論K值

實測K值

校準K值1、理論K值酶活性計算公式

若某酶活性測定沒有可用得校準品

則由酶活性得國際單位定義推算得出:酶活性(U/L)=ΔA/min×ε:指示物質(zhì)得摩爾吸光系數(shù),b:比色杯光徑

VT:反應液總?cè)萘?Vs:樣品容量

自動生化分析儀得b一般會自動校正為1指示物質(zhì)常為NADH(NADPH)和對硝基酚類等

在一定測定條件下得ε已被測定獲知,試劑說明書均會提供因此公式中可計算得出即為理論K值,又稱計算因子,作為分析參數(shù)輸入分析儀中如NADH(NADPH)、對硝基苯酚和對硝基苯胺在405nm得理論ε分別為6220、18700和9870L·mol-1·cm-1因酶校準品制備和保存困難,故早期幾乎所有酶活性測定項目沒有校準品,因而多數(shù)采用理論K值理論K值2、實測K值理論K值受樣品和試劑得加量準確度、比色杯光徑準確度,尤其就是ε得影響ε在波長和溫度等不同時有所不同

試劑說明書得ε可能與實際所用分析儀所測不同

因而有必要獲得用戶所用分析儀得實際ε,再計算K值

此為實測K值(1)還原型輔酶得ε測定NADH(NADPH)沒有標準純制品,配成溶液后穩(wěn)定性又較差,故不能直接用NADH或NADPH標準液測定εHK法測定葡萄糖,葡萄糖消耗與NADH生成呈等摩爾關系根據(jù)A=εbC,已知b和Cs測得As便可計算NADH(NADPH)得ε例如C為10mmo1/L(0、01mol/L),Vs3、5μl,Vr335μl,b0、7cm,340nmA為0、465,則實測εNADH＝6424就就是說此臺分析儀上340nm波長處NADH(NADPH)得實測ε為6424,而理論上NADH(NADPH)得ε為6220利用該實測ε即可計算實測K值(2)色素原底物酶促產(chǎn)物得ε測定有許多酶底物為人工合成得色素原,其本身無色,經(jīng)酶作用后釋放出黃色得反應產(chǎn)物,在405nm波長具有吸收峰最常用色素原底物及其產(chǎn)物為:

ALP:底物磷酸對硝基苯酚(4-NPP)

產(chǎn)物對硝基苯酚(4-NP)

GGT:底物γ-L-谷氨酰對硝基苯胺

或γ-L-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺

產(chǎn)物對硝基苯胺

或5-氨基-2-硝基-苯甲酸色素原底物酶促產(chǎn)物得ε測定測定試劑:①10mmo1/L

4-NP標準儲存液②2、5mmo1/L

4-NP標準應用液,0、84mol/LAMP緩沖液稀釋③底物緩沖液(l5mmol/L4-NPP配于0、84mol/LAMP-HCl緩沖液中,37℃,pHl0、09土0、02)實測ε4-NP＝若測得ΔA為0、460,則:測定方法:4-NP標準應用液5μl,底物緩沖液350μl,波長405nm,光徑0、7cm,溫度37℃,測得A1;另用蒸餾水代替4-NP標準應用液,按上述方法測得A2,4-NP標準液吸光度ΔA=A1－A2＝186623、校準K值酶校準液在分析儀中測定后可自動計算得出校準K值校準K值=(酶活性U/L)s/(ΔA/min)s目前,已得到公認得酶校準品已越來越多,包括ALT、AST、LDH、ALP、GGT、CK、AMY等。酶校準品應具有溯源性,并與所用試劑相配套。酶活性測定過程中得分析條件如溫度、樣品和試劑加量以及吸光度檢測等,可發(fā)生波動或偏差,如同時進行校準液測定,可同等程度地影響校準液和待測樣品,因此使用校準K值通常優(yōu)于理論K值和實測K值。實測K值得得出較麻煩,且一般僅做一次性測定。二、分析參數(shù)設置(analysisparameters)分析參數(shù):自動生化分析儀需要如手工操作類似得分析參數(shù),比如樣品加量、試劑加量、分析波長、分析方法等封閉通道:某些分析儀使用配套試劑時,其分析參數(shù)已存儲在分析儀得硬盤中,用戶不能更改,這些項目稱為封閉通道開放通道:允許用戶修改或設定分析參數(shù)得分析項目分析參數(shù)分類:基本分析參數(shù):若缺乏即無法測定項目特殊分析參數(shù):與保證測定結果得準確性有關,即使不設定也能測定項目。在不同分析儀上差別很大(一)基本分析參數(shù)1、試驗名稱(testname):測定項目標示符,常為英文縮寫2、分析方法(measuringmethod)或方法模式(assaymode):

基本方法為終點法和連續(xù)監(jiān)測法,其她方法均與這兩類方法有關3、測定波長(primarywavelength):可選擇單波長或雙波長(1)主波長(primarywavelength):被檢測物吸收峰處波長應選擇離被測物吸收峰最近處,盡量避開試劑光吸收等干擾(2)次波長(secondarywavelength)使用次波長目得:①消除噪音干擾噪音:從光源到比色杯、單色器、檢測器整個光路均可產(chǎn)生因雙波長同時檢測,兩種波長檢測產(chǎn)生得噪音基本上相同

②減少雜散光影響③減少樣品本身光吸收得干擾如溶血、黃疸和脂濁等干擾可部分消除

次波長設置原則:使干擾物在主、次波長處有盡可能相同得光吸收值而被測物在主、次波長處得光吸收值有較大差異次波長一般大于主波長100nm,主要考慮脂濁問題免疫比濁法測定時次波長得選擇,則就是距離主波長越遠越好,以得到較高得靈敏度采用理論K值測定酶活性:

有些指示物在次波長也有明顯得光吸收,ε必須進行修正指示物主波長ε次波長εNADH3406、22×1033801、33×103對硝基苯酚4041、89×1044760、2×103對硝基苯胺40410、1×1034760、1×103DTNB40413、2×1034762、8×1034、

反應方向(responsedirection):正向反應和負向反應5、樣品量(samplevolum):第一試劑量和第二試劑量根據(jù)分析儀可加樣體積范圍可加試劑體積范圍反應液總體積范圍將樣品量得常量設置到較小量(其減量可至最小加樣量)再按試劑說明書規(guī)定得試劑樣品體積比確定第一和第二試劑量三者總體積需在反應液總體積范圍內(nèi)6、第二試劑(R2)加入時間

樣品和R1加入時間定在反應開始時,R2時間不同分析儀有所不同某些分析儀只有一個固定時間,有些分析儀則有兩個時間點可選可根據(jù)待測物化學反應情況也即時間-吸光度曲線得線形而定多數(shù)情況選擇較早加入R2以利于終點法確實到達終點,連續(xù)監(jiān)測法延滯期和線性期足夠少數(shù)情況較遲加入R2如選擇性抑制法測定HDL-C,R1與血清中非HDL需充分反應使其受抑制,這個過程需要3min～5min又如免疫抑制法測定CK-MB,R1中得抗體抑制M亞基需一定時間7、終點法讀數(shù)時間一點終點法:時間-吸光度曲線最后一個測光點兩點終點法:分別為R2加入前得測光點和最后一個測光點8、速率法讀數(shù)時間

(1)延遲時間(delaytime):速率法中從樣品與反應試劑混勻開始至進入線性期所需得時間存在原因:內(nèi)源性干擾物或抑制劑。延遲時間可因酶所存在介質(zhì)不同而略有差異確定原則:多觀察幾例濃度不等、病理情況不同得樣品得時間-吸光度曲線,選擇延遲時間最長者作為確定值(2)讀數(shù)時間(readtime):需在時間-吸光度曲線得線性期內(nèi),在延遲時間之后即開始選擇整個線性期內(nèi)測光點或稍短于線性期,常1、0～2、5min測光點不應少于4個(3個吸光度變化值)試驗名稱、分析方法、測定波長、反應方向、樣品量與試劑量、第二試劑加入時間、終點法得讀數(shù)時間、速率法得延遲時間和讀數(shù)時間這8類參數(shù)就是最主要得基本分析參數(shù)此外還有兩大類基本參數(shù),包括校準參數(shù)和質(zhì)控參數(shù),也必需設定,分析儀才能進行測定操作9、校準參數(shù)自動生化分析儀以紫外可見光分光光度法為分析技術,根據(jù)朗白-比爾定律,待測物濃度需與校準液(標準液)濃度比較來確定計算公式:終點法:待測物濃度Cu=Au×校準K值

速率法:待測物Cu=ΔAu/min×校準K值

酶活性(U/L)=ΔAu/min×校準K值校準K值:待測物校準K值＝Cs/As(或ΔAs/min)

酶活性校準K值＝酶活性s/(ΔA/min)s校準(calibration):對校準液吸光度檢測并計算K值得過程校準液濃度或酶活性已知,測得校準液吸光度后即得校準K值1點校準:校準曲線呈直線且過坐標零點,用1個濃度校準液2點校準:校準曲線呈直線但不過零點,需用2個濃度校準液多點校準:校準曲線呈非線性需用3個以上濃度校準液

免疫比濁法得校準曲線一般呈非線性

非線性校準曲線可采用多種曲線方程擬合拋物線型采用logit方式:

按校準液個數(shù)選擇logit(3p)、logit(4p)或logit(5p)校準曲線線形不確定或呈S型,用splain(樣條函數(shù))方式(1)校準類型和

校準液個數(shù)拋物線型S型(2)校準液位置和校準液濃度每個校準品均需設定其在樣品盤或樣品架上得專用位置各檢測項目得校準液濃度需輸入分析儀校準品需要與試劑、最好與分析儀都配套,如有可能應溯源到參考方法或參考物質(zhì)

因此,一個測定項目按其所用試劑對應于一個校準品若多個測定項目使用同一品牌得試劑,則該試劑公司可能制備多項目得混合校準品10、質(zhì)控參數(shù)臨床生化所開展得定量檢測項目通常均需做室內(nèi)質(zhì)控每個項目一般要求兩個水平得質(zhì)控品需將這些質(zhì)控品得信息設置在分析儀中包括每個質(zhì)控品名稱和批號、每個測定項目得靶值和標準差(二)特殊分析參數(shù)1、試劑吸光度及其變化得檢查2、酶活性測定準確度得監(jiān)測3、校準檢查4、前帶檢查5、樣品信息監(jiān)測6、樣品預稀釋7、方法學補償系數(shù)8、參考范圍9、線性范圍和可報告范圍1、試劑吸光度及其變化得檢查(1)試劑空白吸光度檢查就是檢查試劑質(zhì)量得一個指標每種試劑本身有一定吸光度(AB)超出為其設定得范圍時分析儀會報警,提示試劑變質(zhì)如:ALP、GGT、AMY試劑,色素原底物可逐漸自身分解生成黃色產(chǎn)物,使其AB升高利用Trinder反應原理得試劑,其中酚類物質(zhì)會逐漸氧化為醌類產(chǎn)物,使AB升高多種試劑中NADH可逐漸氧化為NAD+,其AB會隨時間延長而下降有些試劑久置后變混濁而使AB升高(2)試劑空白速率監(jiān)測在連續(xù)監(jiān)測法中使用,設置在加入R1后待測物未反應得時間段某些試劑在檢測溫度下于檢測過程得短時間內(nèi),可發(fā)生較為明顯得自身分解等變化,使測定結果偏高或偏低如設置了此參數(shù),便能在待測物反應得吸光度變化速率中減去試劑空白速率,從而消除或減少這類誤差如色素原底物能自發(fā)分解產(chǎn)生黃色產(chǎn)物,使測定結果出現(xiàn)正誤差試劑空白速率監(jiān)測膽紅素對堿性苦味酸速率法測定肌酐有負干擾因其在肌酐得檢測波長505nm有較高光吸收且膽紅素在堿性可被氧化,在肌酐反應過程其光吸收呈下降趨勢圖:空白速率法消除膽紅素對肌酐測定得干擾

彈性速率原理2、酶活性測定準確度得監(jiān)測(1)線性檢查(linearcheck)用于連續(xù)監(jiān)測法設定一個非線性度對讀數(shù)時間進行線性判斷

通過將讀數(shù)時間內(nèi)得吸光度值進行線性回歸,計算各點得方差,根據(jù)方差值得大小來判斷該讀數(shù)時間就是否處于線性期(2)彈性速率(flexrate)酶活性測定中,當酶活性太高,在讀數(shù)時間內(nèi)已不呈線性反應。有些儀器具彈性速率功能,能選擇讀數(shù)時間前段仍呈線性得吸光度值計算結果,使酶活性測定得線性范圍得以擴大(3)底物消耗限值(substrateexhaustlimit)在連續(xù)監(jiān)測法得測定項目中,可設置化學反應后吸光度升高(正反應)或下降(負反應)得限值超過此限值說明酶反應得底物消耗過多,已不足以維持底物得零級反應,該檢測結果不準確3、校準檢查(1)離散性檢查在做校準包括試劑空白時,分析儀通常都重復兩次并計算兩次吸光度得差值,其差值可做設定(2)敏感度檢查AS與AB之差應保持相對恒定,可設定范圍(3)偏移檢查非直線及多點校準標準曲線中,標準液各濃度在擬和曲線中得A與實測A之差為偏移值,可設定限值(4)校準系數(shù)檢查本次校準K值與上次校準K值比較得檢查4、前帶檢查典型抗原抗體反應得校準曲線呈S形,曲線下端,抗原(Ag)量很少,抗體過剩,免疫復合物生成很少,稱為前帶(prezone)(圖中0-A段)

濁度隨Ag增加,進入相對線性期(A-B)和平衡區(qū)(B-C)Ag繼續(xù)增加時,因抗體不足導致沉淀增加,濁度反下降,

為抗原過剩區(qū),稱為后帶(postzone)(C-D段),此時測定結果可顯著偏低,這就是透射比濁法得缺陷前帶檢查大多數(shù)分析儀針對以上現(xiàn)象有前帶檢查功能,方式不甚一致反應速度比法:

將添加抗血清后得反應初速度對平均速度之比得出得前帶檢查值,與輸入得前帶界限值(％)進行比較

前帶檢查值＝×1005、樣品信息監(jiān)測樣品溶血、脂濁、黃疸等會對測定結果產(chǎn)生干擾按光譜吸收特性,用雙波長或多波長檢測其性質(zhì)和程度在600nm/570nm、700nm/660nm和505nm/480nm測定樣品吸光度比值得大小6、樣品預稀釋設置樣品量、稀釋劑量和稀釋后樣品量三個數(shù)值便可在分析前自動對樣品進行高倍稀釋7、方法學補償系數(shù)用于糾正不同分析方法間測定結果得不一致性有斜率和截距兩個參數(shù)8、參考范圍超過此范圍得測定結果,儀器會打印出提示9、線性范圍(linearityrange)和可報告范圍樣品結果若超過線性范圍,分析儀將提示多數(shù)分析儀會自動將樣品減量或增量重新測定重測能達到得準確范圍為可報告范圍(三)分析參數(shù)設置舉例以肌酸激酶得某通用試劑盒在某分析儀上使用為例1、某生化分析儀有關參數(shù)得設置范圍總反應容量180μl~350μ,樣品量2μl~35μlR1量20μl~270μl,R2量20μl~270μl第二試劑可加入時間為1、5min和4、5min測光點間隔18s,總反應時間10min2、肌酸激酶試劑盒通用參數(shù)樣品量50μl,R1

1000μl,37℃保溫5min,加R2

500μl波長340nm,延遲時間2min,連續(xù)監(jiān)測2minNADH得ε為6220

3、根據(jù)以上條件進行參數(shù)設置(1)按比例減少樣品量和各試劑量使反應液總?cè)萘吭诜治鰞x180μl~350μl范圍內(nèi)

選擇Vs10μl,R1量200μl,R2量100μl,則VT310μl

或者Vs8μl,R1量160μl,R2量80μl,則VT248μl(2)確定第二試劑加入時間根據(jù)通用參數(shù),應選擇第4、5min為R2加入點(3)確定讀數(shù)時間由于R2在第4、5min加入,換算成監(jiān)測周期為第16、17點之間

加上2min延時,則第24個測光點為第1讀數(shù)點

選擇24~31為讀數(shù)時間

(4)計算理論K值根據(jù)樣品量10μl,R1200μl,R2100μl,ε6、22,b為1,代入計算公式,則:

K=

=

=4984也可采用肌酸激酶校準品,執(zhí)行校準程序來得到校準K值4、對新設置得反應參數(shù)進行試運行開始運行,分析儀對各反應參數(shù)得邏輯合法性進行檢測,若有錯誤,則會顯示錯誤信息并停機,需根據(jù)提示信息對反應參數(shù)進行修改返回章目錄一、基本操作步驟(一)自動生化分析儀得工作過程(二)操作前檢查和校準(三)質(zhì)控品測定(四)病人標本得測定

二、主要得維護保養(yǎng)三、自動化分析與手工操作得比較第三節(jié)

自動生化分析儀得操作方法一、基本操作步驟(一)自動生化分析儀得工作過程自動生化分析儀在測定過程中所有機械步驟均由微處理器根據(jù)已設定得程序進行工作1、取樣、加試劑和混勻

樣品盤轉(zhuǎn)動使樣品進入待測位置,樣品針吸樣到反應杯中反應盤旋轉(zhuǎn)到一定位置;試劑轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)動使所需試劑瓶進入試劑吸取位置,試劑針吸取試劑到反應杯反應盤旋轉(zhuǎn)到一定位置,攪拌混勻2、保溫反應和吸光度檢測反應杯內(nèi)液體在恒溫條件下進行化學反應當反應盤旋轉(zhuǎn)至該反應杯通過吸光度檢測窗口時,即被檢測得到一個吸光度值;再按規(guī)定得間隔時間檢測該反應杯得吸光度值直至總反應結束總反應時間一般為10min,如果18s為吸光度檢測間隔時間,則10min得到34個測光點分析儀能顯示或/和打印反應全過程得時間-吸光度曲線3、計算、顯示或打印結果根據(jù)各測光點吸光度值對某一檢測項目進行結果計算并顯示或打印出每個標本得報告也可按測定項目顯示或打印出全部標本得結果(二)操作前檢查和校準

1、操作前檢查

(1)純水供給就是否正?；蜃懔?/p>

各項分析試劑就是否充足

各種清洗劑就是否足夠

(2)光度計檢查確認光路與檢測系統(tǒng)就是否正常

(可設定在自動開機得程序中)2、校準按分析項目得穩(wěn)定性不同確定不同得校準頻度如每日、每周、每月、每兩月校準,甚至每六個月校準等以下情況必須進行校準:①改變試劑得種類或者批號若能說明改變試劑批號不影響測定結果,可不進行校準②分析儀進行一次大得預防性維護或者更換了重要部件③出現(xiàn)失控,采取一般措施后,不能識別和糾正問題(三)質(zhì)控品測定每批樣品測定均應該有質(zhì)控樣品同時監(jiān)測批測定指一批樣品從開始測定到完成測定后停止得整個過程

其中添加或更新試劑、進行過有可能改變吸光度得維護等操作,均應進行一次質(zhì)控樣品得檢測實際工作中,通常在分析批得開始先進行質(zhì)控品測定,如果室內(nèi)質(zhì)控符合要求即結果在控,則可進行病人標本得測定。失控:13S,22S,R4S,41S,10;12S為警告出現(xiàn)失控需查找原因并加以解決失控原因包括試劑、校準品、質(zhì)控品、儀器因素,以及操作上得失誤(四)病人標本得測定1、項目輸入(1)手工輸入①逐項輸入:將每個標本得所有測定項目逐項地輸入②組合(profile)項目輸入:預先有組合項目設置時可輸入③批量輸入:針對有連續(xù)相同測定項目得標本(2)樣品條碼識別

分析儀自動閱讀樣品條碼,識別樣品信息和需測定項目

可杜絕樣品錯誤和項目輸入錯誤,并進一步減輕人力消耗2、樣品測定

在開始測定畫面,輸入該批第一個標本得標本號,分析儀即會自動逐個地對標本進行測定具有條形碼得樣品不需輸入起始標本號3、急診檢驗幾乎所有全自動生化分析儀都具備“急診優(yōu)先”得功能儀器備有急診樣品分析位置或?qū)Ｓ脴悠芳芗捌鋵Ｓ镁幪栐诩痹\樣品位置上放置了樣品,并輸入急診檢驗項目后,就會在常規(guī)樣品得測定過程中優(yōu)先對該樣品進行分析測定二、主要得維護保養(yǎng)分析儀在操作過程中一般均能進行主要部件自動清洗為保證儀器正常運行,還需嚴格按操作手冊做定期維護1、每天維護

①檢查和清洗樣品針、試劑針、攪拌棒②添加或更換試劑③添加清洗劑等2、每周維護

①比色杯清洗②比色杯空白吸光度檢查③清洗恒溫水槽3、每月維護清洗裝置本身、純水桶、供水過濾器、散熱器過濾網(wǎng)等4、不定期維護對一些易磨損得消耗部件進行檢查與更換:①進樣注射器就是否漏水,各沖洗管路就是否暢通,各機械運轉(zhuǎn)部分就是否工作正常②比色杯就是否需要更換③光源燈就是否需要更換三、自動化分析與手工操作得比較1、優(yōu)點

①檢測速度快②檢測靈敏度高:A1、0~3、0甚至以上且可精確到0、0001

在符合郎白－比爾定律得前提下,線性上限提高③檢測準確度高:能準確判斷終點,能做連續(xù)監(jiān)測法,各種自動監(jiān)測判斷功能④檢測精密度高:取樣和加試劑精度高,人為誤差小,偶然誤差少⑤樣品和試劑用量少⑥其她:包括能精確地控制反應時間、精確地控制反應溫度、能進行復雜得結果計算如非線性計算等2、缺點①無連續(xù)波長可選:選擇合適得次波長有時很困難②操作時間受限