測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的常見(jiàn)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)

測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的常用方法及其優(yōu)缺點(diǎn)周一3組錢(qián)翀&王玉閣常用方法

滲透壓法粘度法光散射法凝膠過(guò)濾層析SDS-凝膠電泳超速離心沉降法電噴霧離子化質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜凝膠過(guò)濾層析法

(GFC)凝膠過(guò)濾層析(gelfiltrationchromatography)法又稱(chēng)排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖類(lèi)物質(zhì)（如葡聚糖或瓊脂糖），使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。一般是大分子先流出來(lái)，小分子后流出來(lái)。凝膠過(guò)濾法，周同惠，《國(guó)外醫(yī)學(xué)參考資料·藥學(xué)分冊(cè)》[J]，1974,1.凝膠過(guò)濾層析法通過(guò)凝膠柱,大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)得到分離。自加入樣品時(shí)算起,至組分最大濃度(峰)出現(xiàn)時(shí)所流出的體積稱(chēng)為“洗脫體積”,以Ve表示。凝膠裝柱后,柱床所占體積稱(chēng)為總體積，以Vt表示。Vo稱(chēng)為“空隙體積”或“外體積”,即柱床內(nèi)存在于凝膠外面的水相的體積。定義Kav

為有效的分配系數(shù)，Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)。凝膠過(guò)濾層析法對(duì)同一類(lèi)型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān)，流過(guò)凝膠柱時(shí)，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關(guān)系可用下式表示：

Ve=K1—K2logMrK1與K2為常數(shù)，Mr為分子量，Ve也可用Ve-Vo（分離體積），Ve/Vo（相對(duì)保留體積），Ve/Vt（簡(jiǎn)化的洗脫體積）或Kav代替，與分子量的關(guān)系同上式，只是常數(shù)不同。凝膠過(guò)濾層析法通常多以Kav對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖,得到一條直線(xiàn),稱(chēng)為“選擇曲線(xiàn)”。每一類(lèi)型的化合物(如球蛋白類(lèi)、右旋糖酐類(lèi)等)有其特殊的選擇曲線(xiàn),可用以測(cè)定未知物的分子量。測(cè)定時(shí)以使用曲線(xiàn)的直線(xiàn)部分為宜。球蛋白分子量選擇曲線(xiàn)凝膠過(guò)濾層析法操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，樣品用量少，周期短，重復(fù)性能好，條件溫和，一般不引起生物活性物質(zhì)的變化，而且有時(shí)不需要純物質(zhì)，粗制品即可，目前已得到相當(dāng)廣泛的應(yīng)用。凝膠層析法測(cè)定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系比較好，但在極端pH時(shí)，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過(guò)5%時(shí)，測(cè)得分子量比真實(shí)的要大，鐵蛋白則與此相反，測(cè)得的分子量比真實(shí)的要小。SDS-凝膠電泳法

SDS是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷。帶上的負(fù)電荷數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素。SDS-凝膠電泳法帶電粒子在單位時(shí)間內(nèi)移動(dòng)的距離稱(chēng)為電泳遷移率。溶液中帶電粒子在電場(chǎng)(E)中向著與它相異電荷的電極移動(dòng)，它的移動(dòng)速度(V)是電場(chǎng)(E)和粒子的有效遷移率(m)的乘積，V＝mE

一般情況下電泳中蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)與遷移率呈線(xiàn)性關(guān)系，具體由凝膠的情況決定。SDS-凝膠電泳法實(shí)驗(yàn)成本較低，儀器設(shè)備也相對(duì)簡(jiǎn)單對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定幾乎無(wú)吸附和電滲作用，樣品分離重復(fù)性好精確程度相對(duì)較低AnalyticalUltracentrifugation(AUC)sedimentationvelocitysedimentationequilibriumAnalyticalUltracentrifugation(AUC)SvedbergequationsedimentationvelocityPicturefromtheInternetLammequationRearrangeAnalyticalUltracentrifugation(AUC)sedimentationequilibriumSvedbergequationhttps:///wiki/Lamm_equationBeckmanOptimaXL-AAnalyticalUltracentrifugePicturefromtheInternetAdvantages&DisadvantagesLowexpenseSimpleequipmentEasilybeaffectedSomeconstantsinequationshouldbetested,relativelytroubleElectrospray

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