醫(yī)學生物化學

生物化學BIOCHEMISTRY

王澤平生物化學與分子生物學教研室蛋白質(zhì)的結構與功能第1章StructureandFunctionofProtein01什么是蛋白質(zhì)?02蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。1833年，從麥芽中分離淀粉酶；隨后從胃液中分離到類似胃蛋白酶的物質(zhì)。0120世紀初，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的二級結構；完成胰島素一級結構測定。041864年，血紅蛋白被分離并結晶。0219世紀末，證明蛋白質(zhì)由氨基酸組成，并合成了多種短肽。03蛋白質(zhì)研究的歷史20世紀中葉，各種蛋白質(zhì)分析技術相繼建立，促進了蛋白質(zhì)研究迅速發(fā)展；011962年，確定了血紅蛋白的四級結構。0220世紀90年代，功能基因組與蛋白質(zhì)組研究地展開。03No.3蛋白質(zhì)的生物學重要性分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分No.2No.1蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能氧化供能作為生物催化劑（酶）代謝調(diào)節(jié)作用免疫保護作用物質(zhì)的轉運和存儲運動與支持作用參與細胞間信息傳遞蛋白質(zhì)的分子組成

TheMolecularComponentofProtein第一節(jié)組成蛋白質(zhì)的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘。各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×100蛋白質(zhì)元素組成的特點由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：1/16%12345一、組成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸均屬于L--氨基酸存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬L-氨基酸（甘氨酸除外）。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式RC+NH3COO-H非極性脂肪族氨基酸極性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸1氨基酸可根據(jù)側鏈結構和理化性質(zhì)進行分類2側鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸側鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸側鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸側鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸側鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性氨基酸幾種特殊氨基酸

脯氨酸（亞氨基酸）CH2CHCOONH2+CH2CH2CH2CHCOONH2+CH2CH2

半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3三、20種氨基酸具有共同或特異的理化性質(zhì)兩性解離及等電點氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。等電點(isoelectricpoint,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。（一）氨基酸具有兩性解離的性質(zhì)pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子”04030102含共軛雙鍵的氨基酸具有紫外吸收性質(zhì)色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收01氨基酸與茚三酮反應生成藍紫色化合物02氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關系，因此可作為氨基酸定量分析方法。四、蛋白質(zhì)是由許多氨基酸殘基組成的多肽鏈氨基酸通過肽鍵連接而形成肽(peptide)肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。1兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……2肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。3由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。4多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。01多肽鏈有兩端：N末端：多肽鏈中有游離α-氨基的一端C末端：多肽鏈中有游離α-羧基的一端02C末端N末端牛核糖核酸酶LOGO體內(nèi)存在多種重要的生物活性肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH還原酶NADPH+H+GSH與GSSG間的轉換2GSHGSH過氧化物酶H2O22H2ONADP+GSSG多肽類激素及神經(jīng)肽神經(jīng)肽(neuropeptide)體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽蛋白質(zhì)的分子結構

TheMolecularStructureofProtein

第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結構包括:

高級結構一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)定義:蛋白質(zhì)的一級結構指在蛋白質(zhì)分子從N-端至C-端的氨基酸排列順序。的一級結構氨基酸的排列順序決定蛋白質(zhì)主要的化學鍵:肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。一級結構是蛋白質(zhì)空間構象和特異生物學功能的基礎，但不是決定蛋白質(zhì)空間構象的唯一因素。主要的化學鍵：氫鍵蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象。二、多肽鏈的局部主鏈構象為蛋白質(zhì)二級結構定義:參與肽鍵形成的6個原子在同一平面上參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元(peptideunit)。參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元(peptideunit)。參與肽鍵形成的6個原子在同一平面上α-螺旋結構是常見的蛋白質(zhì)二級結構蛋白質(zhì)二級結構-螺旋(-helix)-折疊(-pleatedsheet)-轉角(-turn)無規(guī)卷曲(randomcoil)-螺旋-折疊使多肽鏈形成片層結構-轉角-轉角和無規(guī)卷曲在蛋白質(zhì)分子中普遍存在無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。STEP3STEP2STEP1模體是具有特殊功能的超二級結構在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個有規(guī)則的二級結構組合，被稱為超二級結構。二級結構組合形式有3種：αα，βαβ，ββ。二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，稱為模體(motif)。01模體是具有特殊功能的超二級結構。02鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體鋅指結構α-螺旋-β轉角（或環(huán)）-α-螺旋模體鏈-β轉角-鏈模體鏈-β轉角-α-螺旋-β轉角-鏈模體模體常見的形式氨基酸殘基的側鏈對二級結構形成的影響蛋白質(zhì)二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成-螺旋或β-折疊，它就會出現(xiàn)相應的二級結構。三、在二級結構基礎上多肽鏈進一步折疊形成蛋白質(zhì)三級結構疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。主要的化學鍵:整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。定義:（一）三級結構是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置肌紅蛋白(Mb)N端C端分子量較大的蛋白質(zhì)常可折疊成多個結構較為緊密的區(qū)域，并各行其功能，稱為結構域(domain)。纖連蛋白分子的結構域（二）結構域是三級結構層次上的局部折疊區(qū)（三）分子伴侶參與蛋白質(zhì)折疊分子伴侶(chaperon)通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質(zhì)折疊成天然構象或形成四級結構。分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。伴侶蛋白在蛋白質(zhì)折疊中的作用亞基之間的結合主要是氫鍵和離子鍵。含有二條以上多肽鏈的蛋白質(zhì)具有四級結構蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結構。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。02010304血紅蛋白的四級結構由2個亞基組成的蛋白質(zhì)四級結構中，若亞基分子結構相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結構不同，則稱之為異二聚體(heterodimer)。五、蛋白質(zhì)的分類根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分:單純蛋白質(zhì)結合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)部分+非蛋白質(zhì)部分根據(jù)蛋白質(zhì)形狀:纖維狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)六、蛋白質(zhì)組學（一）蛋白質(zhì)組學基本概念蛋白質(zhì)組是指一種細胞或一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)，即“一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)”。蛋白質(zhì)組學研究技術平臺蛋白質(zhì)組學研究的科學意義蛋白質(zhì)組學是高通量，高效率的研究:雙向電泳分離樣品蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)點的定位、切取蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)結構與功能的關系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三節(jié)12（一）一級結構是空間構象的基礎一、蛋白質(zhì)一級結構是高級結構與功能的基礎牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性（二）一級結構相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結構與功能胰島素氨基酸殘基序號A5A6A10B30人ThrSerIleThr豬ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla馬ThrSerIleAla（三）氨基酸序列提供重要的生物化學信息一些廣泛存在于生物界的蛋白質(zhì)如細胞色素(cytochromeC)，比較它們的一級結構，可以幫助了解物種進化間的關系。（四）重要蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變可引起疾病例：鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)

這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。血紅素結構蛋白質(zhì)的功能依賴特定空間結構血紅蛋白亞基與肌紅蛋白結構相似肌紅蛋白/血紅蛋白含有血紅素輔基肌紅蛋白(myoglobin，Mb)肌紅蛋白是一個只有三級結構的單鏈蛋白質(zhì)，有8段α-螺旋結構。血紅素分子中的兩個丙酸側鏈以離子鍵形式與肽鏈中的兩個堿性氨基酸側鏈上的正電荷相連，加之肽鏈中的F8組氨酸殘基還與Fe2+形成配位結合，所以血紅素輔基與蛋白質(zhì)部分穩(wěn)定結合。血紅蛋白(hemoglobin，Hb)血紅蛋白具有4個亞基組成的四級結構，每個亞基可結合1個血紅素并攜帶1分子氧。Hb亞基之間通過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結合而形成親水的球狀蛋白。Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合，Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。01血紅蛋白亞基構象變化可影響亞基與氧結合02肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線協(xié)同效應(cooperativity)一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應(positivecooperativity)123如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應(negativecooperativity)4血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。O2蛋白質(zhì)空間結構的改變伴隨其功能的變化，稱為變構效應。變構效應(allostericeffect)（三）蛋白質(zhì)構象改變可引起疾病蛋白質(zhì)構象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質(zhì)的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病瘋牛病中的蛋白質(zhì)構象改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)01ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein02第四節(jié)蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì)01蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。02當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。03蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)041蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)2蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。3蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素:顆粒表面電荷水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)空間結構破壞而引起變性蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。造成變性的因素:如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質(zhì):——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結構。臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。01此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。02應用舉例:若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)。天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性1在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。2蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。3蛋白質(zhì)沉淀4蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。應用蛋白質(zhì)呈色反應可測定蛋白質(zhì)溶液含量茚三酮反應(ninhydrinreaction)蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。雙縮脲反應(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。010302第五節(jié)01蛋白質(zhì)的分離純化與結構分析TheSeparationandPurificationandStructureAnalysisofProtein02一、透析及超濾法可去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物應用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。透析(dialysis)超濾法利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)沉淀方法01使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。02鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質(zhì)沉淀。03免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。利用荷電性質(zhì)可用電泳法將蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術,稱為電泳(elctrophoresis)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學研究的重要技術。01幾種重要的蛋白質(zhì)電泳:01應用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進行層析分離01層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理03待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。02離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。01凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各