生物中圖版學(xué)案：第六章第一節(jié)蛋白質(zhì)的提取和分離

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精第一節(jié)蛋白質(zhì)的提取和分離1．了解提取生物大分子的基本思路和方法.2．嘗試蛋白質(zhì)的提取。一、蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)將生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)提取出來并加以分離,就可以得到高純度的甚至是單一種類的蛋白質(zhì)。1．蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)包括離心技術(shù)、層析技術(shù)和電泳技術(shù)等.其中,電泳技術(shù)最為快捷靈敏、簡便易行.2．電泳原理蛋白質(zhì)含有游離的氨基和羧基,是兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下帶有電荷。作為帶電粒子，蛋白質(zhì)在電場中可以向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)，這就是電泳現(xiàn)象.蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)越多，移動(dòng)得越快;電荷數(shù)相同時(shí)，相對分子質(zhì)量越小,則移動(dòng)越快。3．不同蛋白質(zhì)的混合溶液，在經(jīng)過同一個(gè)電場電泳后，會(huì)在凝膠上形成不同的帶紋。每一種帶紋可能就是一種蛋白質(zhì)。將這些帶紋一個(gè)一個(gè)地剪下來，分別予以洗脫，然后對洗脫液中的蛋白質(zhì)做進(jìn)一步的分離。如果待測洗脫液不能再分離，則這個(gè)帶紋中很可能含有一種單純蛋白質(zhì)。如果待測洗脫液還能再分離,則這個(gè)帶紋中含有多種蛋白質(zhì)，需要作進(jìn)一步分離，直至提純。二、血清蛋白的提取和分離1．新鮮血液在體外凝固后，會(huì)析出清亮的淡黃色液體-—血清。血清中含有丙種球蛋白、凝集素等多種蛋白質(zhì).2．過程（1）點(diǎn)樣：取新制血清與蔗糖溶液及溴酚藍(lán)指示劑等體積混勻后，小心加到電泳樣品槽的膠面上.(2）電泳。（3）染色：取出凝膠,放入考馬斯亮藍(lán)R250染色液中.染色與固定同時(shí)進(jìn)行,使染色液沒過膠板，染色30min。（4）脫色：用醋酸溶液浸泡漂洗數(shù)次，每隔1~2h更換脫色液,直至底色脫凈，背景清晰。（5）制干膠板：將已脫色的凝膠板放在保存液中浸泡3~4h,然后放在兩層透氣玻璃紙中間,自然干燥即可獲得血清蛋白的電泳譜帶。三、其他蛋白質(zhì)的提取與分離1．牛奶中酪蛋白的提取與檢測當(dāng)pH＝4.8時(shí)，酪蛋白的溶解度降低，并析出沉淀。用酒精除去酪蛋白沉淀中的脂肪后，即得到純的酪蛋白。酪蛋白中含有酪氨酸，能與米倫試劑起顏色反應(yīng)，首先生成白色沉淀，加熱后變成紅色.2．卵清蛋白質(zhì)的分離選取雞、鴨、鵝、鵪鶉等動(dòng)物的新鮮卵清作實(shí)驗(yàn)材料。采用電泳法分離卵清蛋白質(zhì).思考：可否利用蛋白質(zhì)的提取與分離技術(shù)快速診斷早期癌變?提示：可以。只需從早期患者的尿液、血液或細(xì)胞裂解液中提取少量蛋白質(zhì)樣品,采用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)，就可以更加快速、簡便、準(zhǔn)確地對細(xì)胞癌變作出診斷。1．電泳許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下,這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電.在電場的作用下，這些帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同,使帶電粒子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離.兩種常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，在測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量時(shí)通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。而在SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳中，SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈，因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的相對分子質(zhì)量；同時(shí)SDS所帶的大量負(fù)電荷能掩蓋不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。2．用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量時(shí)，可選用一組已知相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和相對分子質(zhì)量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以測定未知蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。具體步驟如下：（1)根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板；（2）SDS—聚丙烯酰胺凝膠制備;（3）樣品處理；（4）把凝膠固定于電泳裝置上；（5）加樣:按順序加樣,加樣量通常為10～25μL，樣品可以多加幾個(gè)；（6)電泳；(7）剝膠;（8）染色；（9）脫色;（10）觀察結(jié)果。SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中，特別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。TEMED和過硫酸銨對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定要按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟，在老師的指導(dǎo)下完成.操作時(shí)要戴好一次性手套。題型一電泳技術(shù)的原理【例題1】關(guān)于電泳的說法不正確的是（)。A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B．帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)C．蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少D．用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子的大小解析：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異,使電泳遷移率完全取決于分子的大小。答案:C反思領(lǐng)悟：反思領(lǐng)悟:電泳利用了分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)不同以及分子本身的大小、形狀不同,使帶電粒子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。題型二蛋白質(zhì)的提純【例題2】（2011·廣東理綜）以下關(guān)于豬血紅蛋白提純的描述，不正確的是（）.A．洗滌紅細(xì)胞時(shí)，使用生理鹽水可防止紅細(xì)胞破裂B．豬成熟紅細(xì)胞中缺少細(xì)胞器和細(xì)胞核，提純時(shí)雜蛋白較少C．血紅蛋白的顏色可用于凝膠色譜法分離過程的監(jiān)測D．在凝膠色譜法分離過程中,血紅蛋白比相對分子質(zhì)量較小的雜蛋白移動(dòng)慢解析：大分子物質(zhì)由于分子直徑較大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快,相反,分子質(zhì)量較小的物質(zhì)向下移動(dòng)速度較慢。答案：D1電泳過程中，什么樣的分子遷移速度最快？（）A．纖維狀、大分子B．纖維狀、小分子C．球狀、大分子D．球狀、小分子解析：電泳就是利用了連續(xù)分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同。一般來說，球狀分子比纖維狀分子易移動(dòng)，小分子比大分子易移動(dòng)。答案:D2下面說法不正確的是（）.A．分離膠和濃縮膠單獨(dú)存在時(shí)具有神經(jīng)毒性，應(yīng)避免接觸皮膚B．電泳需要支持物，常用的是聚丙烯酰胺凝膠C．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程D．透析袋能使大分子自由進(jìn)出，而將小分子保留在袋內(nèi)解析：透析袋一般是用硝酸纖維素（又叫玻璃紙）制成的.透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi).透析可以除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液.答案：D3在盛有紅褐色的Fe（OH）3膠體的U形管的兩個(gè)管口，各插一個(gè)電極，通直流電后，發(fā)現(xiàn)陰極附近的顏色逐漸加深,這