放射免疫技術(shù)（免疫學(xué)檢驗課件）

放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)：是將放射性核素高敏感的示蹤特點和抗原抗體反應(yīng)的高特異性特點相結(jié)合的一種體外測定超微量物質(zhì)的新技術(shù)。具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用。放射免疫技術(shù)根據(jù)其方法學(xué)原理的不同主要有兩種類型：RIA和IRMA。前言第一節(jié)放射性核素和放射性標(biāo)記物的制備放射性核素作為放射性免疫技術(shù)的標(biāo)記物，選擇何種放射性核素以及如何制備放射標(biāo)記物（將放射性核素與抗原或抗體連接），是建立放射免疫技術(shù)的基礎(chǔ)。一、放射性核素的概述基本概念指在自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種放射性核素轉(zhuǎn)變成另一種放射性核素，并同時釋放射線（α、β、γ），又稱為放射性衰變?；绢愋鸵罁?jù)其衰變方式α衰變、β衰變、γ衰變最常用的放射性核素是125I125I的優(yōu)點化學(xué)性質(zhì)比較活潑，標(biāo)記方法簡單，且容易獲得高比活性的標(biāo)記物；在衰變過程中產(chǎn)生γ射線，便于測量且效率高；半衰期適中（60天左右），且廢棄物較容易處理。125I的缺點用125I取代H，可能使原物質(zhì)免疫活性受到影響；易因發(fā)生輻射損傷而使標(biāo)記抗原變性；作為商品化試劑的產(chǎn)品貨架期較短。利用射線照射閃爍體（NaI晶體），導(dǎo)致晶體分子激發(fā)，在退激發(fā)時，閃爍體發(fā)出一定波長的熒光；再由光電倍增管將極微弱的熒光轉(zhuǎn)換成光電子并放大107倍；從光電倍增管輸出的電信號經(jīng)過放大器放大，經(jīng)單道分析器甄別處理，并在定標(biāo)器上顯示。放射性核素放射活性的檢測二、放射性核素標(biāo)記抗原抗體方法主要包括間接標(biāo)記法直接標(biāo)記法（氯胺T法）125I-125I或125I+125I-標(biāo)記物（混合物）Ch-T、LPO氧化取代反應(yīng)（一）直接標(biāo)記法——氯胺T法（Ch-T）

氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成穩(wěn)定的放射標(biāo)記物（二碘酪氨酸），最后加入偏重亞硫酸鈉（還原劑）終止反應(yīng)。（二）間接標(biāo)記法預(yù)先將125I用Ch-T法標(biāo)記琥珀酰胺酯，制成的125I化脂功能基團(tuán)可與蛋白分子上的氨基酸殘基反應(yīng)，從而使待標(biāo)記物被碘化。三、放射標(biāo)記物的純化與鑒定（一）放射標(biāo)記物的純化因游離的125I與125I標(biāo)記抗原（抗體）分子的大小相差懸殊，故采用凝膠層析即可進(jìn)行分離純化聚合、損傷物標(biāo)記蛋白游離125I比放射活性指單位質(zhì)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度放射化學(xué)純度單位標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率應(yīng)大于95%免疫活性標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力標(biāo)記物與過量抗體反應(yīng)百分比該值越大,標(biāo)記物免疫活性好（二）放射標(biāo)記物的鑒定第二節(jié)放射免疫分析

放射免疫分析（RIA）是以放射性核素標(biāo)記的抗原（Ag*）與未標(biāo)記抗原（Ag）競爭結(jié)合特異抗體（Ab）來對待檢樣品中的抗原進(jìn)行定量測定的一種技術(shù)。一、檢測原理RIA屬于競爭性分析，其基本原理是由于Ag*和Ag（待測物Ag)對特異性抗體具有相同的結(jié)合力，當(dāng)三者同時存在于同一反應(yīng)體系時，Ag*和Ag相互競爭結(jié)合特異性抗體。Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結(jié)合位點，二者通過競爭方式與Ab結(jié)合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結(jié)合形成Ag*Ab復(fù)合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關(guān)系。(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag)二、方法與類型非平衡法，即標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣本）和特異性抗體，優(yōu)先使非標(biāo)記抗原與特異性抗體達(dá)到平衡，然后再加入標(biāo)記抗原競爭與抗體結(jié)合。兩種類型平衡法，即標(biāo)記抗原、標(biāo)準(zhǔn)品抗原（或待檢樣本）、特異性抗體同時加入反應(yīng)體系中。三、關(guān)鍵技術(shù)抗原抗體反應(yīng)分離結(jié)合標(biāo)記物（分離技術(shù)）放射性測定數(shù)據(jù)處理Ag*Ag反應(yīng)條件體積溫度時間pHAb(標(biāo)準(zhǔn)Ag/樣品Ag)（一）抗原抗體反應(yīng)牢固的抗原抗體復(fù)合物雙抗體沉淀法

聚乙二醇（PEG)沉淀法

PR試劑法活性炭吸附法分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應(yīng)平衡效果不受反應(yīng)介質(zhì)影響操作應(yīng)簡單、重復(fù)性好經(jīng)濟(jì)（二）分離結(jié)合標(biāo)記物晶體閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和（三）數(shù)據(jù)處理標(biāo)準(zhǔn)曲線

RIA由于具有敏感度高、特異性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好、用血量少、可測定小分子量和大分子量物質(zhì)等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)檢驗中應(yīng)用極為廣泛，常用于各種激素和藥物等的測定。

但由于放射性核素的放射性對人體會產(chǎn)生一定的危害性，且其廢物的儲存和銷毀會對環(huán)境造成污染，因此操作時必須加以注意。四、評價與應(yīng)用第三節(jié)免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是從放射免疫分析（RIA）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核素標(biāo)記免疫測定，其特點為用核素標(biāo)記的抗體直接與待檢抗原反應(yīng)，并用固相免疫吸附劑作為B或F的分離手段。一、檢測原理IRMA屬于非競爭性免疫結(jié)合反應(yīng)，其基本檢測原理是將放射性核素（125I）標(biāo)記在抗體上，并用過量的標(biāo)記抗體與待測抗原進(jìn)行非競爭性結(jié)合反應(yīng)，并采用固相免疫吸附方式對B和F進(jìn)行分離。檢測免疫復(fù)合物的放射性，從而得到待檢樣本的濃度。二、方法與類型（一）單位點IRMA（二）雙位點IRMA三、關(guān)鍵技術(shù)抗原抗體反應(yīng)分離技術(shù)放射性測定數(shù)據(jù)處理Ab*AgAb(待檢Ag)（一）抗原抗體反應(yīng)固相抗原抗體復(fù)合物*牢固的抗原抗體復(fù)合物固相吸附分離技術(shù)（二）分離技術(shù)一般采用物理吸附法：用碳酸鹽緩沖液將預(yù)包被抗體稀釋到3μg/ml~10μg/ml，室溫過夜，棄包被緩沖液（含有未結(jié)合物質(zhì)和過剩標(biāo)記物），并洗滌去掉結(jié)合不牢固抗體，從而達(dá)到分離的目的；然后，再加入1%牛血清白蛋白溶液，封閉、保存?zhèn)溆?。晶體閃爍計數(shù)器包括了NaI閃爍晶體、光電倍增管以及計數(shù)器測量的放射性信號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)(cpm)

參數(shù)cpmB/T(%)F/T(%)B/F(%)B/B0(%)注：T即是B與F的總和（三）數(shù)據(jù)處理

IRMA的優(yōu)點

效率高、操作簡便

靈敏度高

特異型強(qiáng)

穩(wěn)定性好四、評價與應(yīng)用

IRMA的缺點

抗體用量較多

抗體的純化較難IRMA的測定對象主要限于有兩個以上抗原決定簇的肽類或蛋白質(zhì)。適用于大分子蛋白質(zhì)和多肽類激素的檢測分析，如腫瘤標(biāo)志物CA15-3，人血清催乳素、胃蛋白酶，血清TSH、凝血因子、降鈣素、HBsAg等，某些難以標(biāo)記的病毒抗原也可通過IRMA進(jìn)行檢測。小結(jié)

放射免疫技術(shù)是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，通過免疫反應(yīng)進(jìn)行定量測定的一種技術(shù)。有兩種類型經(jīng)典的放射免疫分析（RIA）和免疫放射分析（IRMA）。

放射免疫分析是待測抗原和定量的標(biāo)記抗原競爭