一文讀懂外泌體Exosome【光量分享】

一文讀懂外泌體Exosome【光量分享】本文由光量資本馮德元整理匯總液態(tài)活檢按照檢測(cè)的對(duì)象分類，可以分為核酸水平的ctDNA檢測(cè)和細(xì)胞水平的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）檢測(cè)以及外泌體（Exosome）檢測(cè)。CTC和ctDNA已經(jīng)有了較為深入的研究，并開(kāi)發(fā)出很多基于CTC和ctDNA檢測(cè)技術(shù)的平臺(tái)。近幾年，對(duì)液態(tài)活檢“三駕馬車”之一的外泌體（Exosome）的研究開(kāi)始變得越發(fā)活躍。一、什么是外泌體？外泌體（Exosome）產(chǎn)生于細(xì)胞中的多泡體，是活細(xì)胞分泌的直徑約為30~150nm的膜性囊泡，密度為1.13-1.19g/ml，有典型的“杯盤(pán)”形態(tài)。人體中幾乎所有類型的細(xì)胞均能產(chǎn)生外泌體，近乎于平均每個(gè)人體細(xì)胞產(chǎn)生1000-10000個(gè)。通常1ml血液中存在1×10^12個(gè)外泌體。外泌體具有異質(zhì)性，即使是同一種細(xì)胞分泌的外泌體都有可能具有很大功能區(qū)別。外泌體幾乎存在于所有的組織、細(xì)胞間隙、體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌體攜帶了參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白、miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及其降解片段，參與細(xì)胞活動(dòng)的重要調(diào)控；在腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)控機(jī)制、疾病發(fā)生發(fā)展、阿茲海默癥和免疫疾病等疑難雜癥的治療方面嶄露頭角，有望成為多種疾病的早期診斷標(biāo)志物。二、外泌體研究歷程外泌體的發(fā)現(xiàn)要追溯到1986年，EberhardG.Trams和R.M.Johnstone在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞培養(yǎng)液上清中發(fā)現(xiàn)了一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，并將其命名為Exosome（外泌體）。但外泌體并未引起足夠的重視。1996年，G.Raposo發(fā)現(xiàn)類似于B淋巴細(xì)胞能分泌抗原提呈外泌體，這種外泌體攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明這種B細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以直接刺激效應(yīng)CD4+細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。2007年，H.Valadi等發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞之間可以通過(guò)外泌體中的RNA來(lái)交換遺傳物質(zhì)。這意味著細(xì)胞可以通過(guò)外泌體影響另外一個(gè)細(xì)胞，甚至可以把自己的基因強(qiáng)加給另外一個(gè)細(xì)胞。研究人員逐漸對(duì)小小的外泌體產(chǎn)生了極大的好奇。他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的外泌體與正常細(xì)胞的外泌體之間存在差異，腫瘤的外泌體會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，腫瘤周圍組織細(xì)胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，等等。2013年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了三位科學(xué)家，他們分別是美國(guó)科學(xué)家JamesE.Rothman和RandyW.Schekman，德國(guó)科學(xué)家ThomasC.Südhof，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部囊泡（外泌體等）運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制。使外泌體的研究達(dá)到全新的高度。2015年10月底，康奈爾大學(xué)的DavidLyden等發(fā)現(xiàn)，他們轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞在出發(fā)前會(huì)先行釋放出外泌體，外泌體會(huì)到達(dá)預(yù)期轉(zhuǎn)移的器官，被相應(yīng)的細(xì)胞所攝取，改變這些靶細(xì)胞的狀態(tài)，營(yíng)造一個(gè)適宜轉(zhuǎn)移來(lái)的腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。在這其中，外泌體表面的整合素種類決定著靶器官的特異性，例如整合素α6β4和α6β1與肺轉(zhuǎn)有關(guān)，而整合素αvβ5與肝轉(zhuǎn)有關(guān)。這為抑制抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了新的思路。2016年5月，牛津大學(xué)開(kāi)發(fā)出一種名為EvOx的外泌體治療產(chǎn)品，利用人體細(xì)胞自身精準(zhǔn)通信系統(tǒng)將藥物遞送到身體的特定部分，以治療一些目前無(wú)法治愈的疾病，包括大腦疾病、自身免疫性疾病以及癌癥。EvOx已經(jīng)獲得了由投資公司牛津科學(xué)創(chuàng)新（OxfordSciencesInnovation）1千萬(wàn)歐元的資金資助，主要用于臨床前和早期臨床試驗(yàn)的技術(shù)支持。2016年12月，來(lái)自美國(guó)猶他大學(xué)的研究人員在Nature上發(fā)表文章報(bào)道了自組裝蛋白質(zhì)納米籠（nanocages）的設(shè)計(jì)，它們以一種類似于一些病毒的方式從人類細(xì)胞釋放到小囊泡中。研究人員將這種生物材料稱為“包膜蛋白納米籠”（EPNs），并闡述了蛋白質(zhì)是如何被編程以指導(dǎo)雜交生物材料的形成，并執(zhí)行復(fù)雜的任務(wù)，建立EPNs作為一類設(shè)計(jì)的、模塊化的，遺傳編碼的納米材料，可以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移分子。該方法在藥物遞送方面有很重要的應(yīng)用前景。2017年，納米芯片分離外泌體技術(shù)成為IBM評(píng)選的5種熱門(mén)技術(shù)之一。在過(guò)去十年中，IBM每年要求他們的科學(xué)家和研究人員智囊團(tuán)，選擇出被廣泛應(yīng)用的最熱門(mén)的五種技術(shù)（5in5）。2017的5in5的榜單著眼于利用納米技術(shù)、人工智能和半導(dǎo)體制造的發(fā)展，產(chǎn)生新一代的儀器和工具。三、外泌體的構(gòu)成截止目前已經(jīng)通過(guò)286項(xiàng)研究，在外泌體中發(fā)現(xiàn)了41860種蛋白質(zhì)、2838種microRNA、3408種mRNA。外泌體的膜同細(xì)胞一樣，是磷脂雙分子層。外泌體膜含有MHC-1/2蛋白，能綁定特異性的肽鏈；還有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白annexins、RAN、GTPases。外泌體膜上有脂質(zhì)筏Chol、ceramide、SM、PC，限制膜流動(dòng)，參與包括跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)內(nèi)吞、脂質(zhì)及蛋白定向分選的多種功能。外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括A33（結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)、CD86(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)以及乳凝集素（不成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞）。外泌體中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA；同時(shí)還有一些蛋白、脂類也能被包裹到外泌體中。外泌體中常見(jiàn)的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶(GTPases,)家族的一種。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細(xì)胞的融合，現(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。此外與外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子有：Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。一些物質(zhì)進(jìn)入外泌體中是特異性的：如hnRNPA2B1能結(jié)合lncRNA或miRNA特異性的序列（GGAG/CCCU），進(jìn)行主動(dòng)包埋。其它一些外泌體中的蛋白包括多種的代謝類的酶（GAPDH,烯醇化酶1,醛縮酶1,PKM2,PGK1,PDIA3,GSTP1,DPP4,AHCY,TPL1,抗氧化蛋白,P4HB,LDH,親環(huán)素A,FASN,MDH1和CNP）、核糖體蛋白（RPS3）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（黑色素瘤分化相關(guān)因子,ARF1,CDC42,人類紅細(xì)胞膜整合蛋白,SLC9A3R1）、粘附因子（MFGE8、整合素）、細(xì)胞骨架蛋白以及泛素等。四、外泌體：腫瘤轉(zhuǎn)移的器官傾向性腫瘤轉(zhuǎn)移的器官傾向性（OrganotropicMetastasis）指的是某些原發(fā)腫瘤特別容易在特定的器官中產(chǎn)生新的病灶。雖然上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化會(huì)幫助腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，但是游動(dòng)的腫瘤細(xì)胞仍然需要?？康揭粋€(gè)合適的組織環(huán)境，只有這樣才可增生成為新的腫瘤。腫瘤通過(guò)外泌體可以改造受體組織的微環(huán)境，使其更適于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于不同外泌體對(duì)不同器官的親和力各異。腫瘤產(chǎn)生的外泌體更傾向與腫瘤轉(zhuǎn)移位點(diǎn)附近的細(xì)胞融合。外泌體之所以能夠精確靶向特異的細(xì)胞并與它們結(jié)合，可能是由于外泌體表面的某些膜蛋白和脂類，特別是與細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附有關(guān)的分子。例如，在最終會(huì)轉(zhuǎn)移到肺部的腫瘤所釋放外泌體的表面，所具有整合素的種類是a6b4和a6b1。而當(dāng)整合素類型為avb5時(shí)，這些腫瘤便會(huì)轉(zhuǎn)移至肝臟。當(dāng)與靶向組織結(jié)合后，這些外泌體還可以激活一系列有利于腫瘤存活的過(guò)程，包括細(xì)胞外基質(zhì)的改造和血管生成。五、外泌體影響免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞要想成功增殖成為新的病灶，需要逃過(guò)人體固有和治療誘發(fā)的免疫監(jiān)視。最新發(fā)現(xiàn)顯示，腫瘤釋放的外泌體可能在免疫調(diào)節(jié)方面有重要作用。腫瘤釋放的外泌體可以通過(guò)削弱免疫效應(yīng)細(xì)胞的反應(yīng)和激發(fā)免疫抑制細(xì)胞的擴(kuò)增，來(lái)營(yíng)造一個(gè)免疫抑制的環(huán)境。例如，實(shí)體瘤和白血病患者的外泌體能夠?qū)е翪D8陽(yáng)性T細(xì)胞的凋亡和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增生，并降低自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性。腫瘤釋放的外泌體可以替代腫瘤細(xì)胞接受免疫系統(tǒng)的攻擊，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃過(guò)免疫系統(tǒng)的識(shí)別。例如，在某些B細(xì)胞淋巴瘤中，表達(dá)CD20的外泌體可以截獲針對(duì)CD20的抗體Rituximab，從而減少抗體與靶細(xì)胞的結(jié)合。外泌體對(duì)免疫療法的影響將是未來(lái)研究的一個(gè)重要課題。腫瘤釋放的外泌體可以引發(fā)炎癥，利用基質(zhì)浸潤(rùn)細(xì)胞的反應(yīng)營(yíng)造出利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。六、外泌體的分離外泌體的分離方法主要有：差速離心、密度梯度離心、體積排阻色譜法、過(guò)濾法、聚合物沉淀法、免疫分離、隔離篩選法等。超速離心：耗時(shí)耗力，往往需要8-30個(gè)小時(shí)；每次最多只能處理6個(gè)樣品；需要大量的起始材料和超速離心機(jī)；產(chǎn)量不高。具體步驟為：將欲提取的細(xì)胞培養(yǎng)上清液10ml，在4℃的環(huán)境下，300×g10min，2000×g20min，棄沉淀，去除細(xì)胞；然后l0,000×g30min，棄沉淀，去除亞細(xì)胞成分；再用10,000×g60min，棄掉上清液，最后所得沉淀既為exosome，用30mlPBS溶液重新懸浮沉淀物，混勻后再以10,000×g60min，用lmlPBS溶液懸浮沉淀物提純的exosome溶液分別裝入eppendorf管內(nèi)，置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。磁珠免疫捕獲：利用外泌體表面特有的表面標(biāo)記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來(lái)。磁珠法具有特異性高、操作簡(jiǎn)便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn)，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)，難以廣泛普及。Exo系列外泌體分離試劑盒：外泌體分離試劑盒通過(guò)簡(jiǎn)單離心，從體液、血液、尿液、細(xì)胞中分離外泌體（Exosome），相比超速離心，安全、快速，經(jīng)過(guò)兩次柱子純化，很好的去除了白蛋白，從而獲得高純度和高產(chǎn)量的外泌體。七、外泌體的檢測(cè)在下游分析方面，分離純化出來(lái)的exosome可以做蛋白分析，也可以做RNA（microRNA和LncRNA）檢測(cè)。蛋白分析SDS：可分析得到的Exosome中蛋白的含量及種類。Western-Blot：通過(guò)Western-Blot可以檢測(cè)Exosome中特定的蛋白表達(dá)情況。2-DE等蛋白組學(xué)分析：可以了解Exosome中不同蛋白的表達(dá)、數(shù)量情況透射電鏡通過(guò)透射電鏡可以分析Exosome的大小、形態(tài)等，再結(jié)合免疫標(biāo)記可以很清楚的分析特定指標(biāo)在Exosome表達(dá)的部位。基因水平Real-TimePCR：通過(guò)PCR可以分析需要研究的指標(biāo)的表達(dá)量轉(zhuǎn)錄組分析：通過(guò)測(cè)序或者芯片，分析Exosome不同基因的轉(zhuǎn)錄水平miRNA：通過(guò)測(cè)序或者芯片，檢測(cè)與Exosome相關(guān)的miRNA的表達(dá)情況，研究特定的miRNAlncRNA分析：通過(guò)測(cè)序或者芯片，檢測(cè)與Exosome相關(guān)的lncRNA的表達(dá)情況，研究特定的lncRNA與Exosome共同調(diào)控某種疾病的關(guān)系參考引用：一文讀懂丨揭開(kāi)外泌體的神秘面紗轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)外泌體解決方案盡在這里諾禾致源外泌體的家譜MedSci關(guān)于外泌體，你想知道的都在這兒了……小張聊科研外泌體發(fā)展之路bio360外泌體的世界（一）CellMax胎牛血清外泌體：腫瘤轉(zhuǎn)移的先鋒部隊(duì)藥明康德關(guān)于外泌