紫外-可見分光光度法

模塊一紫外-可見分光光度法一、背景知識一、背景知識一、背景知識(一)基本原理1.概述紫外一可見分光光度法是利用物質(zhì)對紫外一可見光的吸收特征和吸收強度，對物質(zhì)進行定性和定量分析的一種儀器分析方法。該方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，儀器設(shè)備簡單，操作方便，在化工、醫(yī)藥、冶金、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。2.基本特性(波粒二象性)光是一種電磁波，實驗證實，電磁波(電磁輻射)是一種以極高速度傳播的光量子流。它既具有粒子性，也具有波動性。下一頁返回一、背景知識1)波動性其特征是每個光子具有一定的波長，可以用波的參數(shù)如波長(λ)、頻率(v)、周期(T)等來描述。由于在真空中，所有電磁波均以同樣的最大速度"C”傳播(C=2.998x108m/s)。波長:電磁波按頻率(或波長)可分為各種不同的電磁波，見表1-1。2)粒子性電磁輻射與物質(zhì)之間能量的轉(zhuǎn)移用粒子性來解釋。輻射能是由一顆一顆不連續(xù)的粒子流傳播的，這種粒子叫光(量)子。上一頁下一頁返回一、背景知識光量子具有能量E：式中h—普朗克常數(shù)，其值為6.626X10-34J·s。由公式(1-2)可知:波長越長的光所具有的能量越小，波長越短的光具有的能量越大。)3.光與物質(zhì)的作用1)單色光和復(fù)合光單色光，即單一頻率(或波長)的光。由幾種單色光合成的光叫做復(fù)色光，又稱“復(fù)合光”。包含多種頻率的光比較多見，例如太陽光、弧光等。一般的光源是由不同波長的單色光所混合而成的復(fù)色光，自然界中的太陽光及人工制造的日光燈等所發(fā)出的光都是復(fù)色光。上一頁下一頁返回一、背景知識圖1-1列出了各種色光的近似波長范圍。日常見到的日光、白熾燈光等白光就是由這些波長不同的有色光混合而成的。這可以用一束白光通過棱鏡后色散為紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等七色光來證實。2)互補色光如果某兩種相對應(yīng)顏色的光按一定比例混合，可以成為白光，那么這兩種色光就稱為互補色光。圖1-2中兩兩相對的顏色即為互補色光，如黃光和藍光。上一頁下一頁返回一、背景知識3)物質(zhì)的顏色與吸收光的關(guān)系當(dāng)一束白光作用于某一物質(zhì)時，如果該物質(zhì)對可見光各波段的光全部吸收，物質(zhì)呈黑色;如果該物質(zhì)對可見光區(qū)各波段的光都不吸收，即入射光全部透過，則物質(zhì)呈透明無色;若物質(zhì)吸收了某一波長的光，而讓其余波段的光都透過，物質(zhì)則呈吸收光的互補色光的顏色。4)物質(zhì)的吸收光譜曲線吸收光譜曲線是通過實驗獲得的，具體方法是:將不同波長的光依次通過某一固定濃度和厚度的有色溶液，分別測出它們對各種波長光的吸收程度(用吸光度A表示)，以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，畫出曲線，此曲線即稱為該物質(zhì)的光吸收曲線(或吸收光譜曲線)，它描述了物質(zhì)對不同波長光的吸收程度。圖1-3所示的是三種不同濃度的KMnO4溶液的三條光吸收曲線。上一頁下一頁返回一、背景知識5)分子吸收光譜的產(chǎn)生機理(1)分子運動及其能級躍遷。物質(zhì)總是在不斷運動著，而構(gòu)成物質(zhì)的分子及原子具有一定的運動方式。通常認(rèn)為分子內(nèi)部運動方式有三種，即分子內(nèi)電子相對原子核的運動(稱為電子運動);分子內(nèi)原子在其平衡位置上的振動(稱為分子振動);以及分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動(稱為分子轉(zhuǎn)動)。分子以不同方式運動時所具有的能量也不相同，這樣分子內(nèi)就對應(yīng)三種不同的能級，即電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級。圖1-4是雙原子分子能級分布示意圖。上一頁下一頁返回一、背景知識通常化合物的分子處于穩(wěn)定的基態(tài)，但當(dāng)它受光照射時，則根據(jù)分子吸收光能的大小，引起分子轉(zhuǎn)動、振動或電子躍遷，同時產(chǎn)生三種吸收光譜。分子由一個能級E1躍遷到另一個能級E2時的能量變化△E為二能級之差，即:(2)分子吸收光譜的產(chǎn)生。一個分子的內(nèi)能E是它的轉(zhuǎn)動能E轉(zhuǎn)、振動能E振和電子能E電子之和，即分子躍遷的總能量變化為:上一頁下一頁返回一、背景知識4.光吸收定律1)朗伯-比爾定律當(dāng)一束平行的單色光垂直照射到一定濃度的均勻透明溶液時，入射光被溶液吸收的程度與溶液厚度的關(guān)系為:單色光通過溶液時被吸收的程度，通常稱為吸光度，用A表示，即上一頁下一頁返回一、背景知識當(dāng)一束平行單色光垂直照射到同種物質(zhì)不同濃度、相同液層厚度的均勻透明溶液時，入射光通量與溶液濃度關(guān)系為:這就是比爾定律。比爾定律表明:當(dāng)溶液液層厚度和入射光通量一定時，光吸收的程度與溶液濃度成正比。必須指出的是:比爾定律只能在一定濃度范圍才適用。因為濃度過低或過高時，溶質(zhì)會發(fā)生電離或聚合，而產(chǎn)生誤差。當(dāng)溶液厚度和濃度都可改變時，這時就要考慮兩者同時對透射光通量的影響，則有:上一頁下一頁返回一、背景知識2)吸光系數(shù)式(1-9)中比例常數(shù)K稱為吸光系數(shù)，其物理意義是:單位濃度的溶液液層厚度為1cm時，在一定波長下測得的吸光度。K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液濃度大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因溶液濃度所采用的單位的不同而異。(1)摩爾吸光系數(shù)ε。當(dāng)溶液的濃度以物質(zhì)的量濃度(mol/L)表示，液層厚度以厘米(cm)表示時相應(yīng)的比例常數(shù)K稱為摩爾吸光系數(shù)。以ε表示，其單位為L/(mol·cm)。這樣式(1-9)可以改寫成:上一頁下一頁返回一、背景知識(2)質(zhì)量吸光系數(shù)。質(zhì)量吸光系數(shù)適用于摩爾質(zhì)量未知的化合物。若溶液濃度以質(zhì)量濃度ρ(g/L)表示，液層厚度以厘米(cm)表示，相應(yīng)的吸光度，則為質(zhì)量吸光度，以a表示，其單位為L/(g·cm)。這樣，式(1-9)可表示為:3)吸光度的加和性在多組分的體系中，在某一波長下，如果各種對光有吸收的物質(zhì)之間沒有相互作用，則體系在該波長的總吸光度等于各組分吸光度的和，即吸光度具有加和性，稱為吸光度加和性原理。可表示如下:上一頁下一頁返回一、背景知識4)引起偏離朗伯-比爾定律的主要因素根據(jù)朗伯-比爾定律，在理論上，吸光度A對溶液濃度c作圖應(yīng)是一條通過原點的直線，稱為“標(biāo)準(zhǔn)曲線”。但事實上往往容易發(fā)生偏離直線的現(xiàn)象而引起誤差，尤其是在高濃度時。導(dǎo)致偏離朗伯-比爾定律的因素主要有以下幾方面。(1)入射光非單色性引起偏離。吸收定律成立的前提是入射光是單色光。但實際上，一般單色器所提供的入射光并非是純單色光，而是由波長范圍較窄的光帶組成的復(fù)合光。而物質(zhì)對不同波長的吸收程度不同(即吸光系數(shù)不同)，因而導(dǎo)致了對吸光定律的偏離。入射光中不同波長的摩爾吸光系數(shù)差別愈大，偏離吸收定律就愈嚴(yán)重。實驗證明，只要所選的入射光，其所含的波長范圍在被測溶液的吸收曲線較平坦的部分，偏離程度就要小。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)溶液的化學(xué)因素引起偏離。溶液中的吸光物質(zhì)因離解、締合，形成新的化合物而改變了吸光物質(zhì)的濃度，導(dǎo)致偏離吸收定律。因此，測量前的化學(xué)預(yù)處理工作十分重要，如控制好顯色反應(yīng)條件，控制溶液的化學(xué)平衡等，以防止產(chǎn)生偏離。(3)比爾定律的局限性引起偏離。嚴(yán)格說，比爾定律是一個有限定律，它只適用于濃度小于0.01mol/L的稀溶液。因為濃度高時，吸光粒子間平均距離減小，以致每個粒子都會影響其鄰近粒子的電荷分布。上一頁下一頁返回一、背景知識(二)目視比色法1.方法原理目視比色法原理是:將有色的標(biāo)準(zhǔn)溶液和被測溶液在相同條件下對顏色進行比較，當(dāng)溶液液層厚度相同、顏色深度一樣時，兩者的濃度相等。根據(jù)光吸收定律2.測定方法目視比色法常用標(biāo)準(zhǔn)系列法進行定量。具體方法是:向插在比色管架上(如圖1-5所示)的一套直徑、長度、玻璃厚度、玻璃成分等都相同的平底比色管中，依次加入不同量的待測組分標(biāo)準(zhǔn)溶液和一定量顯色劑及其他輔助試劑，并用蒸餾水或其他溶劑稀釋到同樣體積，配成一套顏色逐漸加深的標(biāo)準(zhǔn)色階。上一頁下一頁返回一、背景知識3.目視比色法的特點目視比色法的優(yōu)點是:儀器簡單、操作方便，適宜于大批樣品的分析;由于比色管長度長，自上而下觀察，顏色很淺，也容易比較出深淺，靈敏度較高。另外，它還不需要單色光，可直接在白光下進行，對渾濁溶液也可進行分析。目視比色法的缺點是:主觀誤差大、準(zhǔn)確度差，而且標(biāo)準(zhǔn)色階不宜保存，需要定期重新配制，較費時。上一頁下一頁返回一、背景知識(三)紫外-可見分光光度計1.儀器的基本組成部件在紫外及可見光區(qū)用于測定溶液吸光度的分析儀器稱為紫外一可見分光光度計(簡稱分光光度計)。目前，紫外一可見分光光度計的型號較多，但它們的基本構(gòu)造都相似，都由光源、單色器、樣品吸收池、檢測器和信號顯示系統(tǒng)等五大部件組成，其組成框圖見圖1-6。1)光源光源的作用是供給符合要求的入射光。分光光度計對光源的要求是:在使用波長范圍內(nèi)提供連續(xù)的光譜，光強應(yīng)足夠大，有良好的穩(wěn)定性，使用壽命長。實際應(yīng)用的光源一般分為可見光光源和紫外光光源。上一頁下一頁返回一、背景知識(1)可見光光源。鎢絲燈是最常用的可見光光源，它可發(fā)射波長為325~2500nm范圍的連續(xù)光譜，其中最適宜的使用范圍為320~1000nm，除用做可見光源外，還可用做近紅外光源。為了保證鎢絲燈發(fā)光強度穩(wěn)定，需要采用穩(wěn)壓電源供電，也可用12V直流電源供電。(2)紫外光光源。紫外光光源多為氣體放電光源，如氫、氛、氛放電燈等。其中應(yīng)用最多的是氫燈及其同位素氛燈，其使用波長范圍為185~375nm。為了保證發(fā)光強度穩(wěn)定，也要用穩(wěn)壓電源供電。氛燈的光譜分布與氫燈相同，但光強比同功率氫燈要大3~5倍，壽命比氫燈長。上一頁下一頁返回一、背景知識2)單色器單色器的作用是把光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解成單色光，并能準(zhǔn)確方便地“取出”所需要的某一波長的光，它是分光光度計的心臟部分。單色器主要由狹縫、色散元件和透鏡系統(tǒng)組成。其中色散元件是關(guān)鍵部件，色散元件是棱鏡和反射光柵或兩者的組合，它能將連續(xù)光譜色散成為單色光。(1)棱鏡單色器。棱鏡單色器是利用不同波長的光在棱鏡內(nèi)折射率不同將復(fù)合光色散為單色光的。棱鏡色散作用的大小與棱鏡制作材料及幾何形狀有關(guān)。常用的棱鏡用玻璃或石英制成?？梢姺止夤舛扔嬁梢圆捎貌ＡЮ忡R，但玻璃吸收紫外光，所以不適用于紫外光區(qū)。紫外-可見分光光度計采用石英棱鏡，它適用于紫外、可見整個光譜區(qū)。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)光柵單色器。光柵作為色散元件具有不少獨特的優(yōu)點。光柵可定義為一系列等寬、等距離的平行狹縫。光柵的色散原理是以光的衍射現(xiàn)象和干涉現(xiàn)象為基礎(chǔ)的。常用的光柵單色器為反射光柵單色器，它又分為平面反射光柵和凹面反射光柵兩種，其中最常用的是平面反射光柵。3)吸收池吸收池又叫比色皿，是用于盛放待測液和決定透光液層厚度的器件。吸收池一般為長方體(也有圓鼓形或其他形狀，但長方體最普遍)，其底及二側(cè)為毛玻璃，另兩面為光學(xué)透光面。根據(jù)光學(xué)透光面的材質(zhì)，吸收池有玻璃吸收池和石英吸收池兩種。上一頁下一頁返回一、背景知識4)檢測器檢測器又稱接收器，其作用是對透過吸收池的光做出響應(yīng)，并把它轉(zhuǎn)變成電信號輸出，其輸出電信號大小與透過光的強度成正比。常用的檢測器有光電池、光電管及光電倍增管等，它們都是基于光電效應(yīng)原理制成的。作為檢測器，對光電轉(zhuǎn)換器要求是:光電轉(zhuǎn)換有恒定的函數(shù)關(guān)系，響應(yīng)靈敏度要高、速度要快，噪聲低、穩(wěn)定性高，產(chǎn)生的電信號易于檢測放大等。(1)光電池。光電池是由三層物質(zhì)構(gòu)成的薄片，表層是導(dǎo)電性能良好的可透光金屬薄膜，中層是具有光電效應(yīng)的半導(dǎo)體材料(如硒、硅等)，底層是鐵片或鋁片(見圖1-7)。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)光電管。光電管在紫外一可見分光光度計中應(yīng)用廣泛。它是一個陽極和一個光敏陰極組成的真空二極管。按陰極上光敏材料的不同，光電管分藍敏和紅敏兩種。(3)光電倍增管。光電倍增管是檢測弱光最常用的光電元件，它不僅響應(yīng)速度快，而且靈敏度高，比一般光電管高200倍。5)信號顯示器由檢測器產(chǎn)生的電信號，經(jīng)放大等處理后，用一定方式顯示出來，以便于計算和記錄。信號顯示器有多種，隨著電子技術(shù)的發(fā)展，這些信號顯示和記錄系統(tǒng)將越來越先進。上一頁下一頁返回一、背景知識2.紫外-可見分光光度計的類型及特點紫外-可見分光光度計按使用波長范圍可分為:可見分光光度計和紫外-可見分光光度計兩類。前者的使用波長范圍是400~780nm;后者的使用波長范圍為200~1000nm?？梢姺止夤舛扔嬛荒苡糜跍y量有色溶液的吸光度，而紫外-可見分光光度計可測量在紫外、可見及近紅外有吸收的物質(zhì)的吸光度。紫外-可見分光光度計按光路可分為單光束式及雙光束式兩類;按測量時提供的波長數(shù)又可分為單波長分光光度計和雙波長分光光度計兩類。1)單光束分光光度計所謂單光束是指從光源中發(fā)出的光，經(jīng)過單色器等一系列光學(xué)元件及吸收池后，最后照在檢測器上時始終為一束光。其工作原理如圖1-8所示。上一頁下一頁返回一、背景知識2)雙光束分光光度計雙光束分光光度計工作原理如圖1-9所示。從光源中發(fā)出的光經(jīng)過單色器后被一個旋轉(zhuǎn)的扇形反射鏡(即切光器)分為強度相等的兩束光，分別通過參比溶液和樣品溶液。利用另一個與前一個切光器同步的切光器，使兩束光在不同時間交替地照在同一個檢測器上，通過一個同步信號發(fā)生器對來自兩個光束的信號加以比較，并將兩信號的比值經(jīng)對數(shù)變換后轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的吸光度值。3)雙波長分光光度計雙波長分光光度計與單波長分光光度計的主要區(qū)別在于采用雙單色器，以同時得到兩束波長不同的單色光，其工作原理如圖1-10所示。上一頁下一頁返回一、背景知識(四)可見分光光度法1.顯色反應(yīng)和顯色劑1)顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)可以是氧化還原反應(yīng)，也可以是配位反應(yīng)，或是兼有上述兩種反應(yīng)，其中配位反應(yīng)應(yīng)用最普遍。同一種組分可與多種顯色劑反應(yīng)生成不同有色物質(zhì)。在分析時，究竟選用何種顯色反應(yīng)較適宜，應(yīng)考慮下面幾個因素。(1)選擇性好。一種顯色劑最好只與一種被測組分起顯色反應(yīng)，或顯色劑與共存組分生成的化合物的吸收峰與被測組分的吸收峰相距比較遠，干擾少。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)靈敏度高。要求反應(yīng)生成的有色化合物的摩爾吸光系數(shù)大。實際分析中還應(yīng)該綜合考慮選擇性。(3)生成的有色化合物組成恒定，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，測量過程中應(yīng)保持吸光度基本不變，否則將影響吸光度測定準(zhǔn)確度及再現(xiàn)性。(4)如果顯色劑有色，則要求有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大，以減小試劑空自值，提高測定的準(zhǔn)確度。(5)顯色條件要易于控制，以保證其有較好的再現(xiàn)性。2)顯色劑常用的顯色劑可分為無機顯色劑和有機顯色劑兩大類。上一頁下一頁返回一、背景知識(1)無機顯色劑。許多無機試劑能與金屬離子發(fā)生顯色反應(yīng)，但由于靈敏度和選擇性都不高，具有實際應(yīng)用價值的品種很有限。表1-2列出了幾種常用的無機顯色劑，以供參考。(2)有機顯色劑。有機顯色劑與金屬離子形成的配合物其穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性都比較高，而且有機顯色劑的種類較多，實際應(yīng)用廣。表1-3列出了幾種重要的有機顯色劑。上一頁下一頁返回一、背景知識(3)三元配合物顯色體系。前面所介紹的多是一種金屬離子(中心離子)與一種配位體配位的顯色反應(yīng)，這種反應(yīng)生成的配合物是二元配合物。近年來以形成三元配合物為基礎(chǔ)的分光光度法受到關(guān)注。由于利用三元配合物顯色體系可以提高測定的靈敏度，改善分析特性，因此已得到廣泛應(yīng)用，有些成熟的方法，也已被納入新修訂的國家標(biāo)準(zhǔn)中。2.顯色條件的選擇顯色反應(yīng)是否滿足分光光度法要求，除了與顯色劑性質(zhì)有關(guān)以外，控制好顯色條件是十分重要的。上一頁下一頁返回一、背景知識1)顯色劑用量設(shè)M為被測物質(zhì)，R為顯色劑，MR為反應(yīng)生成的有色配合物，則此顯色反應(yīng)可以用下式表示:2)溶液酸度酸度是顯色反應(yīng)的重要條件，它對顯色反應(yīng)的影響主要有下面幾方面。(1)當(dāng)酸度不同時，同種金屬離子與同種顯色劑反應(yīng)，可以生成不同配位數(shù)的不同顏色的配合物。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)溶液酸度過高會降低配合物的穩(wěn)定性，特別是對弱酸型有機顯色劑和金屬離子形成的配合物的影響較大。當(dāng)溶液酸度增大時顯色劑的有效濃度要減少，顯色能力被減弱。有色物的穩(wěn)定性也隨之降低。因此顯色時，必須將酸度控制在某一適當(dāng)范圍內(nèi)。(3)溶液酸度變化，顯色劑的顏色可能發(fā)生變化。其原因是:多數(shù)有機顯色劑往往是一種酸堿指示劑，它本身所呈的顏色隨pH變化而變化。(4)溶液酸度過低可能引起被測金屬離子水解，因而破壞了有色配合物，使溶液顏色發(fā)生變化，甚至無法測定。上一頁下一頁返回一、背景知識3)顯色溫度不同的顯色反應(yīng)對溫度的要求不同。大多數(shù)顯色反應(yīng)是在常溫下進行的，但有些反應(yīng)必須在較高溫度下才能進行或進行得比較快。4)顯色時間在顯色反應(yīng)中應(yīng)該從兩個方面來考慮時間的影響。一是顯色反應(yīng)完成所需要的時間，稱為“顯色(或發(fā)色)時間”;二是顯色后有色物質(zhì)色澤保持穩(wěn)定的時間，稱為“穩(wěn)定時間”。確定適宜時間的方法:配制一份顯色溶液，從加入顯色劑開始，每隔一定時間測吸光度一次，繪制吸光度-時間關(guān)系曲線。曲線平坦部分對應(yīng)的時間就是測定吸光度的最適宜時間。上一頁下一頁返回一、背景知識5)溶劑的選擇有機溶劑常?？梢越档陀猩镔|(zhì)的離解度，增加有色物質(zhì)的溶解，從而提高了測定的靈敏度。6)顯色反應(yīng)中的干擾及消除(1)干擾離子的影響。分光光度法中共存離子的干擾主要有以下幾種情況。①共存離子本身具有顏色。②共存離子與顯色劑或被測組分反應(yīng)，生成更穩(wěn)定的配合物或發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使顯色劑或被測組分的濃度降低，妨礙顯色反應(yīng)的完成，導(dǎo)致測量結(jié)果偏低。上一頁下一頁返回一、背景知識③共存離子與顯色劑反應(yīng)生成有色化合物或沉淀，導(dǎo)致測量結(jié)果偏高。若共存離子與顯色劑反應(yīng)后生成無色化合物，但由于消耗了大量的顯色劑，致使顯色劑與被測離子的顯色反應(yīng)不完全。(2)干擾的消除方法。干擾離子的存在給分析工作帶來不小的影響。為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，需要采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硐@些影響。消除共存離子干擾的方法很多，此處僅介紹幾種常用方法，以便在實際工作中選擇使用。①控制溶液的酸度。這是消除共存離子干擾的一種簡便而重要的方法?？刂扑岫仁勾郎y離子顯色，而干擾離子不生成有色化合物。上一頁下一頁返回一、背景知識②加入掩蔽劑，掩蔽干擾離子。采用掩蔽劑來消除干擾的方法是一種有效而且常用的方法。該方法要求加入的掩蔽劑不與被測離子反應(yīng)，掩蔽劑和掩蔽產(chǎn)物的顏色必須不干擾測定。③改變干擾離子的價態(tài)以消除干擾。利用氧化還原反應(yīng)改變干擾離子價態(tài)，使干擾離子不與顯色劑反應(yīng)，以達到目的。④選擇適當(dāng)?shù)娜肷涔獠ㄩL消除干擾。⑤選擇合適的參比溶液可以消除顯色劑和某些有色共存離子干擾。⑥分離干擾離子。當(dāng)沒有適當(dāng)掩蔽劑或無合適方法消除干擾時，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法(如電解法、沉淀法、溶劑萃取及離子交換法等)，將被測組分與干擾離子分離，然后再進行測定。其中萃取分離法使用較多，可以直接在有機相中顯色。上一頁下一頁返回一、背景知識3.測量條件的選擇在測量吸光物質(zhì)的吸光度時，測量準(zhǔn)確度往往受多方面因素的影響。如儀器波長準(zhǔn)確度、吸收池性能、參比溶液、入射光波長、測量的吸光度范圍、測量組分的濃度范圍等都會對分析結(jié)果的準(zhǔn)確度產(chǎn)生影響，必須加以控制。1)入射光波長的選擇當(dāng)用分光光度計測定被測溶液的吸光度時，首先需要選擇合適的入射光波長。選擇入射光波長的依據(jù)是該被測物質(zhì)的吸收曲線。在一般情況下，應(yīng)選用最大吸收波長作為入射光波長。上一頁下一頁返回一、背景知識2)參比溶液的選擇在分光光度分析中測定吸光度時，由于入射光的反射，以及溶劑、試劑等對光的吸收會造成透射光通量的減弱。(1)溶劑參比。當(dāng)試樣溶液的組成比較簡單，共存的其他組分很少且對測定波長的光幾乎沒有吸收，僅有待測物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收時，可采用溶劑作參比溶液，這樣可以消除溶劑、吸收池等因素的影響。(2)試劑參比。如果顯色劑或其他試劑在測定波長有吸收時，此時應(yīng)采用試劑作參比溶液。即按顯色反應(yīng)相同條件，只是不加入試樣，同樣加入試劑和溶劑作為參比溶液。這種參比溶液可消除試劑中的組分產(chǎn)生的影響。上一頁下一頁返回一、背景知識(3)試液參比。如果試樣中其他共存組分有吸收，但不與顯色劑反應(yīng)，則當(dāng)顯色劑在測定波長無吸收時，可用試樣溶液作參比溶液，即將試液與顯色溶液作相同處理，只是不加顯色劑。這種參比溶液可以消除有色離子的影響。(4)褪色參比。如果顯色劑及樣品基體有吸收，這時可以在顯色液中加入某種褪色劑，選擇性地與被測離子配位(或改變其價態(tài))，生成穩(wěn)定無色的配合物，使已顯色的產(chǎn)物褪色，用此溶液作參比溶液，稱為褪色參比溶液。褪色參比是一種比較理想的參比溶液，但遺憾的是并非任何顯色溶液都能找到適當(dāng)?shù)耐噬椒??？傊?，選擇參比溶液時，應(yīng)盡可能全部抵消各種共存有色物質(zhì)的干擾，使試液的吸光度真正反映待測物的濃度。上一頁下一頁返回一、背景知識3)吸光度測量范圍的選擇任何類型的分光光度計都有一定的測量誤差，但對一個給定的分光光度計來說，透射比讀數(shù)誤差△T都是一個常數(shù)(其值在±0.2%~±2%。4.定量方法可見分光光度法的最廣泛和最重要的用途是做微量成分的定量分析，它在工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中都占有十分重要的地位。進行定量分析時，由于樣品的組成情況及分析要求的不同，因此分析方法也有所不同。1)單組分樣品的分析如果樣品是單組分的，且遵守吸收定律，這時只要測出被測吸光物質(zhì)的最大吸收波長(λmax)，就可在此波長下，選用適當(dāng)?shù)膮⒈热芤?，測量試液的吸光度，然后再用工作曲線法或比較法求得分析結(jié)果。上一頁下一頁返回一、背景知識(1)工作曲線法。工作曲線法又稱標(biāo)準(zhǔn)曲線法，它是實際工作中使用最多的一種定量方法。工作曲線的繪制方法是:配制4個以上濃度不同的待測組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空自溶液為參比溶液，在選定的波長下，分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制曲線(見圖1-11)，此曲線即稱為工作曲線(或稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線)。工作曲線可以用一元線性方程表示，即:A=b+c(1-14)式中C—標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度;A—相應(yīng)的吸光度;a,b—回歸系數(shù)，其直線稱為回歸直線，其中to為直線斜率，a為直線截距。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)比較法。這種方法是用一個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(Cs)，在一定條件下，測得其吸光度As，然后在相同條件下測得試液cx的吸光度Ax，設(shè)試液、標(biāo)準(zhǔn)溶液完全符合，朗伯-比爾定律，則使用這種方法要求:Cx與Cs濃度應(yīng)接近，且都符合吸收定律。比較法適于個別樣品的測定。上一頁下一頁返回一、背景知識2)多組分定量測定多組分是指在被測溶液中含有兩個或兩個以上的吸光組分。進行多組分混合物定量分析的依據(jù)是吸光度的加和性。假設(shè)溶液中同時存在兩種組分、和J，它們的吸收光譜一般有下面兩種情況。(1)吸收光譜曲線不重疊[見圖1-12(a)]，或至少可找到在某一波長處x有吸收而y不吸收，在另一波長處J有吸收而、不吸收[見圖1-12(b)

]，則可分別在波長λ1和λ2處測定組分x和y，而相互不產(chǎn)生干擾。(2)吸收光譜曲線重疊(見圖1-13)時，可選定兩個波長入，和入2并分別在λ1和λ2處測定吸光度A1和A2，根據(jù)吸光度的加和性，列出如下方程組:上一頁下一頁返回一、背景知識3)高含量組分的測定紫外-可見分光光度法一般適用于含量為10-

2~10-

6mol/L濃度范圍的測定。過高或過低含量的組分，由于溶液偏離吸收定律或因儀器本身靈敏度的限制，會使測定產(chǎn)生較大誤差，此時若使用差示法就可以解決這個問題。差示法又稱為差示分光光度法。它與一般分光光度法區(qū)別僅僅在于它采用一個已知濃度成分與待測溶液相同的溶液作參比溶液(稱為參比標(biāo)準(zhǔn)溶液)，而其測定過程與一般分光光度法相同。然而正是由于使用了這種參比標(biāo)準(zhǔn)溶液，才大大地提高測定的準(zhǔn)確度，使其可用于測定過高或過低含量的組分。上一頁下一頁返回一、背景知識4)雙波長分光光度法所謂雙波長分光光度法就是從光源發(fā)出的光經(jīng)過兩個單色器得到兩束不同波長(λ1和λ2)的單色光，并借助切光器使λ1和λ2交替通過同一吸收池(見圖1-14)，測定二波長吸光度差值△A，求得待測組分含量的方法。雙波長法測定混合組分通常采用等吸收法，如圖1-14所示。雙波長分光光度法適用于混合物和渾濁試樣的測定。同時由于采用一個吸收池，消除了參比液和吸收池差異的影響，提高了方法的準(zhǔn)確度。上一頁下一頁返回一、背景知識(五)紫外分光光度法1.概述紫外分光光度法是基于物質(zhì)對紫外光的選擇性吸收來進行分析測定的方法。根據(jù)電磁波譜，紫外光區(qū)的波長范圍是10~400nm,紫外分光光度法主要是利用200~400nm的近紫外光區(qū)的輻射(200nm以下遠紫外光輻射會被空氣強烈吸收)進行測定。紫外吸收光譜與可見吸收光譜同屬電子光譜，都是由分子中價電子能級躍遷產(chǎn)生的，不過紫外吸收光譜與可見吸收光譜相比，卻具有一些突出的特點。上一頁下一頁返回一、背景知識它可用來對在紫外光區(qū)內(nèi)有吸收峰的物質(zhì)進行鑒定和結(jié)構(gòu)分析，雖然這種鑒定和結(jié)構(gòu)分析由于紫外吸收光譜較簡單，特征性不強，必須與其他方法(如紅外光譜、核磁共振波譜和質(zhì)譜等)配合使用，才能得出可靠的結(jié)論，但它還是能提供分子中具有助色團、生色團和共扼程度的一些信息，這些信息對于有機化合物的結(jié)構(gòu)推斷往往是很重要的。紫外吸收光譜與可見吸收光譜一樣，常用吸收光譜曲線來描述。即用一束具有連續(xù)波長的紫外光照射一定濃度的樣品溶液，分別測量不同波長下溶液的吸光度，以吸光度對波長作圖得到該化合物的紫外吸收光譜。上一頁下一頁返回一、背景知識2.方法原理1)有機化合物紫外吸收光譜的產(chǎn)生紫外吸收光譜是由化合物分子中3種不同類型的價電子，在各種不同能級上躍遷產(chǎn)生的。這3種不同類型的價電子是:形成單鍵的σ電子、形成雙鍵的π電子和氧或氮、硫、鹵素等含未成鍵的n電子。這3類電子都可能吸收一定的能量躍遷到能級較高的反鍵軌道上去，見圖1-15。2)紫外吸收光譜常用術(shù)語(1)生色團和助色團。所謂生色團是指在200~1000nm波長范圍內(nèi)產(chǎn)生特征吸收帶的具有一個或多個不飽和鍵和未共用電子對的基團。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)紅移和藍移。由于取代基或溶劑的影響造成有機化合物結(jié)構(gòu)的變化，使吸收峰向長波方向移動的現(xiàn)象稱為吸收峰“紅移”。由于取代基或溶液的影響造成有機化合物結(jié)構(gòu)的變化，使吸收峰向短波方向移動的現(xiàn)象稱為吸收峰“藍移”。(3)增色效應(yīng)和減色效應(yīng)。由于有機化合物的結(jié)構(gòu)變化使吸收峰摩爾吸光系數(shù)增加的現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。由于有機化合物的結(jié)構(gòu)變化使吸收峰的摩爾吸光系數(shù)減小的現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。上一頁下一頁返回一、背景知識(4)溶劑效應(yīng)。由于溶劑的極性不同引起某些化合物的吸收峰的波長、強度及形狀產(chǎn)生變化，這種現(xiàn)象稱為溶劑效應(yīng)。又如苯在非極性溶劑庚烷中(或汽態(tài)存在)時，在230~270nm處，有一系列中等強度吸收峰并有精細結(jié)構(gòu)(見圖1-16)，但在極性溶劑中，精細結(jié)構(gòu)變得不明顯或全部消失呈現(xiàn)一寬峰。(5)吸收帶的類型。吸收帶是指吸收峰在紫外光譜中譜帶的位置?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)不同，躍遷的類型不同，吸收帶的位置、形狀、強度均不相同。根據(jù)電子及分子軌道的種類吸收帶可分為以下四種類型。上一頁下一頁返回一、背景知識①R吸收帶。R吸收帶由德文Radikal(基團)而得名。②K吸收帶。K吸收帶由德文Konjugation(共扼作用)得名。③B吸收帶。B吸收帶由德文Benzenoic}(苯)得名。④E吸收帶。E吸收帶由德文Kthylenicband(乙烯型)而得名。3.常見有機化合物的紫外吸收光譜1)飽和烴飽和碳氫化合物只有。電子，因而只能產(chǎn)生σ→σ*躍遷。2)不飽和脂肪烴①含孤立不飽和鍵的烴類化合物。②含共扼體系的不飽和烴。③芳香化合物。④雜環(huán)化合物。上一頁下一頁返回一、背景知識4.紫外吸收光譜的應(yīng)用1)定性鑒定不同的有機化合物具有不同的吸收光譜，因此根據(jù)化合物的紫外吸收光譜中特征吸收峰的波長和強度可以進行物質(zhì)的鑒定和純度的檢查。(1)未知試樣的定性鑒定。紫外吸收光譜定性分析一般采用比較光譜法。所謂比較光譜法是將經(jīng)提純的樣品和標(biāo)準(zhǔn)物用相同溶劑配成溶液，并在相同條件下繪制吸收光譜曲線，比較其吸收光譜是否一致。上一頁下一頁返回一、背景知識(2)推測化合物的分子結(jié)構(gòu)。紫外吸收光譜在研究化合物結(jié)構(gòu)中的主要作用是推測官能團、結(jié)構(gòu)中的共扼關(guān)系和共扼體系中取代基的位置、種類和數(shù)目。①推定化合物的共扼體系、部分骨架。先將樣品盡可能提純，然后繪制紫外吸收光譜。由所測出的光譜特征，根據(jù)一般規(guī)律對化合物做初步判斷。如果化合物有許多吸收峰，甚至延伸到可見光區(qū)，則可能為一長鏈共扼化合物或多環(huán)芳烴。按以上規(guī)律進行初步推斷后，能縮小該化合物的歸屬范圍，然后再按前面介紹的對比法做進一步確認(rèn)。當(dāng)然還需要其他方法配合才能得出可靠結(jié)論。上一頁下一頁返回一、背景知識②區(qū)分化合物的構(gòu)型。例如肉桂酸有兩種構(gòu)型:順式和反式。它們的波長吸收強度不同，由于反式構(gòu)型沒有立體障礙，偶極矩大，而順式構(gòu)型有立體障礙。因此反式的吸收波長和強度都比順式的大。③互變異構(gòu)體的鑒別。紫外吸收光譜除應(yīng)用于推測所含官能團外，還可對某些同分異構(gòu)體進行判別。(3)化合物純度的檢測。紫外吸收光譜能檢查化合物中是否含有紫外吸收的雜質(zhì)，如果化合物在紫外光區(qū)沒有明顯的吸收峰，而它所含的雜質(zhì)在紫外光區(qū)有較強的吸收峰，就可以檢測出該化合物所含的雜質(zhì)。上一頁下一頁返回一、背景知識2)定量分析紫外分光光度定量分析與可見分光光度定量分析的定量依據(jù)和定量方法相同，這里不再重復(fù)。值得提出的是，在進行紫外定量分析時應(yīng)選擇好測定波長和溶劑。(六)常用儀器的維護與保養(yǎng)1.日常維護(1)儀器應(yīng)置于適宜工作的場所。①環(huán)境溫度在1