世界衛(wèi)生組織人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊第五版

本手冊的出版由UNDP/UNFPA/WHO/世界銀行人類生殖研究、發(fā)展和研究(UniversityofCalifornia,Davis,CA,USA)提供形態(tài)學顯微照片以及對媒體文件的精子細胞；DrGaryNClarke(TheRoyalWomen′sHospital,Carlton,Australia),DrRoelofMenkveld(TygerbergAcademicHospitalandUniversityofStellenbosch,這個版本的手冊是為紀念已故前WHO男性生育調控方法學工作組負責人AIartificialinsemination人工授精AIDartificialinseminationwithdonorsemen供精人工AIHartificialinseminationwithhusband’ssemen夫精人ALHamplitudeoflateralheaddisplacement頭側擺振幅ANOVAanalysisofvariance變量分析APAAPalkalinephosphatase:anti-alkalinephosphatasecomplex堿性磷酸酶:抗ARacrosome-reacted頂體反應ARTassistedreproductivetechnology輔助生殖ASAanti-spermantibody抗精子BCFbeat-crossfrequency(Hz)交打BWWBiggers,WhittenandWhittingham試液CASAcomputer-aidedspermanalysisCASMAcomputeraidedspermmorphometricassessment計算機輔助精子形態(tài)評估CBAVDcongenitalbilateralabsenceofthevasdeferens先天性雙側輸精管缺失CDcytoplasmicdropleCD45clusterofdetermination45(pan-leukocytemarker)決定簇45(全白細胞標CD46clusterofdetermination46(acrosomalantigen)決定簇4DNAdeoxyribonucleicacid脫氧DPBSDulbecco’sphosphate-bufferedsalineDulbecco’s磷DVDdigitalversatiledisc數(shù)字externalqualityassurancexcessresidualcytoplagameteintrafallopiantransfer輸hydrogenperoxide過氧化氫Hanks’balancedsaltsolutionHankshCGhumanchorionicgonadotrophin人絨毛膜促性腺HIVhumanimmunodefciencyvirus人免疫HOPhamsteroocytepenetration倉HOShypo-osmoticswelling低滲HPFhighpowerfield高倍HRPhorseradishperoxidase辣根過HSAhumanserumalbuminxivHTFhumantubalfuid人輸IBTimmunobeadtest免ICSIintracytoplasmicsperminjection胞Igimmunoglobulin免IUIintrauterineinsemination宮腔內KRMKrebs-RingerMediumKrebs-Ringer培LLQlowerlimitofquantifcation定量下限LPFlowpowerfieldMADmeanangulardisplacement平MAImultipleanomaliesindex復合異MARmixedantiglobulinreaction混合抗球NAnumericalaperture數(shù)值孔徑NPnon-progressive(motilityPBSphosphate-bufferedsaline磷酸緩PMSGpregnantmareserumgonadotrophin孕PNPGp-nitrophenolglucopyranoside對硝基苯酚吡PSAPisumsativumagglutinin碗RCFrelativecentrifugalforce相RIrefractiveindex屈光RNAribonucleicacid核糖ROSreactiveoxygenspecies活性氧rpmrevolutionsperminute每分鐘轉速SOPstandardoperatingprTBSTris-bufferedsTGGTyrode’sglucoseTZIteratozoospermiaindex畸VAPaveragepathvelocity平均軌道VSLstraight-line(rectilinear)velocity直線速率WHOWorldHealthOrganization世界衛(wèi)WOBwobble(VAP/VCL)擺動該手冊已改版三次，被譯成多國語言。過去30年中，該手冊作為全球范圍內的些試驗用于某些特定情況下或由實驗人員選擇研究試驗（這些試驗目前不作到對睪丸和附睪獲得精子的制備。本手冊中散在分布的方法學注釋框有注解(方法學解釋)、評論（結果解釋）以及說明框精液分析章節(jié)包括涉及工作溶液的配制、操作流程、精子計數(shù)及對結果解釋的詳細描述，以使所有給出的方法學都非常完整，與手冊中其它章節(jié)內容的擴展了精子制備部分的內容，增加了關于精子冷凍保存的新章節(jié)。與宮頸粘液分析相關的操作規(guī)程被分到可供選擇的試驗章節(jié)及附錄中粘液特征的檢查與先前的版本相比，第五版的附錄內容減少。這部分內容僅限于特殊的或者精子數(shù)目的評估。對于一份精液標本的檢查，精液的稀釋度和評估精子數(shù)目所需觀察的計數(shù)池區(qū)域的大小均有所改變，每次需計數(shù)200條精子。新版手冊中強調了抽樣誤差的重要性及計數(shù)結果的確定性。編輯委員會認為每次排精的總數(shù)目比精子密度能更準確的評估睪丸功能，但這要求對精液量的測定無精子癥的評估。這盡管表面看起來簡單，但很多因素會影響無精子癥的診斷，包括計數(shù)太少數(shù)目精子導致的明顯誤差，觀察顯微鏡視野的數(shù)目，以及檢驗布滿碎片精子沉淀物的困難度。本手冊推薦改為檢驗固定后、未離心的標本，以及指出所用計數(shù)方法的靈敏度。然而，當需收集足夠數(shù)目的精子用于治療時，離心方法仍是必需的。另外，手冊中也介紹了通過檢驗未固定標精子活力的評估。第五版與先前版本的主要不同在于對精子活力的分級。目前推薦精子活力被分為前向運動、非前向運動的不動精子（而不再分為a,b,精子形態(tài)的評估。一些實驗室僅僅評估正常精子的比例，然而有些人認為形質控。此章第五版為重新編寫。精液分析過程的健全對于精液分析嚴格質控精液樣本。傳統(tǒng)統(tǒng)計學方法為取雙向參考區(qū)間的第2.5百分位作為閾值，低本手冊所載的方法可作為指南以增進精液的綜合分析和可比性。但并非為這些多變的非可控因素解釋了眾所周知的個體精液成分的變化(Bake1996;Carlsen等,2004;(以上數(shù)據(jù)提供由先靈葆雅和拜耳藥業(yè)提供)精液分析包括以下幾個步驟(在以后章節(jié)中詳述):【在最初五分鐘】將受精精液樣本容器放置在溫控臺或水浴箱里(37℃)等待液化。在30到60分鐘期間評估精液的液化情況和物理性狀。如有需要則檢測精液的pH值。準備濕片觀察顯微鏡下精子的活動情況，計數(shù)時還需進行稀釋。如活動精子較少，需評估精子活動率。制作精液涂片評估精子形態(tài)。對精液進行稀釋后做精子密度評估。對精子進行計數(shù)。如有需要可進行抗免疫珠混合反應檢測。如發(fā)現(xiàn)圓形細胞則可檢測過氧化酶陽性細胞?！驹诋斎丈院螅ㄈ缋鋬鰳颖緞t可在次日）】些高度黏稠的樣本減輕粘稠的方法同處理精液液化延精液主要是由精囊腺和前列腺的分泌物和占小部分的尿道球腺和附睪分泌注釋1：低精液體積是生殖道梗阻或先天性雙側輸精管缺如（CBAVD）(delaTaille等,1998;Weiske等,2000;Daudin等,2000;vonEckardstein等,2000)的特精液pH值主要反映出由精囊腺分泌的堿性液體和之間的平衡情況。應在精液液化30分鐘后進行，無對于生育男性精液pH值的參考值尚未確定，現(xiàn)保松分類的精子數(shù)目（見框2.7和2.10，表準化，以保持精子在固定厚度約20μm條件下自由游動蓋上22mm×22mm的蓋玻片，形成近20μm厚度框2.4濕片的厚度：2.4.3節(jié))或精子的凝集(見2.4.4節(jié))。在一起，為非特異性聚集(圖2.2),這種情況應如實記錄。應其程度(1-4級))和吸附狀態(tài)(A-E級)也應記錄(Rose等，1976)(見圖涉及部分聚集等級完全分離聚集精子數(shù)<10多數(shù)精子為游離狀態(tài)中等聚集聚集精子數(shù)10~50有游離精子高度聚集聚集精子數(shù)>50部分精子游離所有精子均聚集一團，無游離精子1.輕度聚集指每個凝塊中少于10條精子；A.頭對頭C.尾端對尾端D.混合型E.糾結型注釋1:存在凝集并不能充分證實為不育的免疫性原因，但是能夠說明有抗精子抗體的存在；還需進一步檢查以明確診斷(見2.20節(jié))。注釋2:嚴重的精子凝集能夠影響對精子活力和密度的評估。精液中常含有一定的非精子細胞成分，部分與臨床關系密切。通常包括泌尿生殖道上皮細胞、前列腺細胞、生精細胞和白細胞，后兩種統(tǒng)稱為“圓細胞”(Johanisson等，2000)。這些細胞成分在染色后的涂片中(放大1000倍)難以區(qū)別(見2.12節(jié)，表13和14,以及2.19節(jié))。可以通過過氧化物酶技術和全白細胞單克隆抗原技術來進行鑒別。非精子細胞成分計數(shù)用與精子相同的方法進行，或根據(jù)染片(見節(jié))中生精細胞或白細胞與精子的比例來進行計算。(山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖中心董乾江蘇無錫婦幼保健院生殖中心王洪華)精子活力評估應在精液樣本液化后盡快（最好在30分鐘之內）進行，務必在射精后1個小時之內進行。防止時間過長，因脫水、pH值及溫建議采用一個簡單的精液運動分類方法，該方法根據(jù)精子運動功能的不同分進行細分，如將在37℃下精子運動速度大于25微米/秒的定義為A等，這種方℃。·在離蓋玻片至少5μm的區(qū)域內觀察精子的運動（蓋玻片邊緣的精子運動M987654321情況下)。011223456789框2.6:關于百分比的比例值和差值處理百分比要四舍五入成整數(shù)，若尾數(shù)是0.5則將其轉換至離兩者均數(shù)，如將32.5%寫成32%,而將3.5%寫成4%。這些四舍五入成的百分比全部加起來可能不等于100%。對照表2.1,若兩個標本PR、NP、IM比例的差值剛好等于可接受的最大差新計數(shù)。(千萬不要再做一份相同的標本，計算三個標本的平均值，或者選擇數(shù)例1:某兩份精液標本(每個標本的精子數(shù)均大于200)的精子能動性分析如下，運動活躍型精子分別占30%和50%;非運動活躍型精子分別占5%和15%;完全不動型精子分別占65%和35%。占比例最大的為完全不動型，它們的均值為50%。對照表2.1,在均值為50%的情況下，差值大于10%,認為僅是偶然發(fā)生事件。觀察值大于10%(65%-35%),因此需重新制作兩份標本進行評估。例2:某兩份精液標本(每個標本的精子數(shù)均大于200)的精子能動性分析如下：運動活躍型精子分別占37%和28%;非運動活躍型精子分別占5%和6%;完全不動型精子分別占60%和66%，占比例最大的為完全不動型，它們的均值信區(qū)間積極運動精子（PR）比例的參考下限為32%（95%的可信度，31-342.6.1曙紅（伊紅苯胺黑法評估精子的到顯微鏡下觀察。1.曙紅Y:將0.67克曙紅和0.9克氯化鈉溶入到100毫升純凈水中，并輕微加熱。2.曙紅一苯胺黑：將10克苯胺黑加到配好的100毫升的曙紅Y試劑中。3.將其加熱至沸騰，然后冷卻至室溫。1.將精液樣本拌勻。2.將1/5的精液與5μl伊紅溶液混合，置于顯微鏡載玻片上，用移液管混勻，在載玻片上均勻展開。3.重新攪拌精液樣本，然后重復步驟2制作另外相同一份。4.將兩份樣本的懸浮液分別涂抹在不同的載波片上(見2.13.2節(jié)),然后置正常參考下限活精子(細胞膜完整精子)比例的參考下限為58%(置信度為95%,置信2.6.2僅用曙紅(伊紅)染料評估精子活力試劑的制備2.曙紅Y染劑，0.5%(w/v):將0.5g曙紅Y(比色指數(shù)，45380)染料溶于100ml濃度為0.9%的NaCl溶液中。9.以表2.1或是圖A7.2，附錄7為標準（在僅考慮樣本誤差的前提下，均1.存活精子的頭部染色為白色或淡粉色，死亡精子的頭部染色為紅色或深2.如果染色僅限于頸部區(qū)域，剩余的頭部未染色，則可認為是“頸部細胞活精子（細胞膜完整精子）比例的參考下限為58%（置信度為95%，置信5.37℃下準確孵化5分鐘或306.按上述步驟，再次混勻精液樣本，再次吸取標本，混入膨脹液，孵化，1.通過細胞形狀的改變來確認膨脹的精子，如顯示為尾部卷縮(圖2.6)。2.精子尾部有膨脹表現(xiàn)則可認定為存活精子；將所有尾部膨脹的精子均計為圖2.6低滲膨脹狀態(tài)下的人類精子的典型形態(tài)變化表現(xiàn)示意圖(a)無變化(b)—(g)不同的尾部變化灰色區(qū)域提示為腫脹的尾部。正常參考下限HOS檢驗的參考值接近于曙紅檢驗的參考值(Carreras等，1992)。活性精子(細胞膜完整精子)比例的參考下限為58%(置信度為95%,置信區(qū)間為55-63)。注釋一次射精的精液中的精子細胞膜的完整性的總數(shù)目是有生物學意義的。細胞膜完整的精子數(shù)目可通過一次射精的總精子數(shù)乘以細胞膜完整精子的百分率Larsenetal,2000)。此推論已為生殖率與精子總數(shù)之間關系的諸多資料所證明。射精時精子的數(shù)量，是由鑒定精液得出的精子密度來統(tǒng)計。對于正常射精，當男性生殖道是通暢的且禁欲時間短，每次射精時的精子總數(shù)均與睪丸容積有關子總數(shù)是衡量睪丸成生精子的能力(MacLeod&Wang,1979)及男性生殖道通暢的指標。與受精和妊娠率相關的精液中精子濃度受精囊(Eliasson,1975)和前列腺分泌多少的影響，并非是睪丸功能的特異性指標。積獲得。）：推薦使用100μm深血球細胞計數(shù)器為計數(shù)池，因Neubauer（牛鮑氏）血球度是有效的(Seaman等,1996;Mahmoud等,1997;BraNeubauer血球細胞計數(shù)器得到的結果將會不同。通過毛細管作用填充的淺計數(shù)池，由于流動精子不會均勻分布(Douglas-Hamilton等,2005a,2005b)。該誤差能夠被校正(Douglas-Hamilton等,2005a)，但校正并非是完全正確的(Bj?rndahl&Barratt，2005)。這種可選擇的計數(shù)池，其有效性須經計數(shù)池核查量綱來確定(見附錄7,A7.8節(jié))，將Neubauer改良的血細胞計數(shù)器法得出的結果加以比較，獲號,0.44mm)，由0.1mm玻璃柱支撐，覆蓋網格。每個計數(shù)區(qū)分成九個1mm×圖2.7改良的Neubauer(紐鮑爾氏)血球細胞計數(shù)器蝕刻區(qū)略圖如下所示：血球細胞計數(shù)器計數(shù)池的所有九個網格(左邊面板);25個大方格中的中央網格(5號)(中間面板);顯微鏡下已充填的一個數(shù)精池的部分(右邊面板),即中央網格的25個方格之一(中間面板的圓圈所示),其由三重線圍出，包含16個小方格。2.7.3血球細胞計數(shù)器網格的使用·只對整個精子(包括頭和尾)進行計數(shù)。邊的不予計數(shù)(見圖2.8,右邊面板)。2.7.4計數(shù)器的維護·使用后，用水清洗血細胞計數(shù)器數(shù)精池和蓋玻片，然后用相機(鏡頭)專三線的中間線確定了方格的邊界(黑線，左邊面板)。除頭部在兩條內線之間(白圈)的精子之外，方格中央的所有精子均計數(shù)，但頭部在兩條外線之間的需計數(shù)(黑圈)。頭部大部分在中間線上的精子，如果該中線低于方格(白圈，2.7.5稀釋后精液的固定2.如果急需，加0.25g臺盼藍(顏色所引23859)或5mL(>4mg/ml)飽和的結晶紫(顏色所引42555),以加亮精子頭部。2.7.6計數(shù)足夠數(shù)量精子的重要性為降低樣本誤差，精子的臨界數(shù)量(大約200條重復計數(shù)時，總數(shù)400條以區(qū)間(CI)接近N±1.96×√N(或為N±2×√N左右)。如果計數(shù)100個精子，那么標準誤差(SE)即為10(√100),其95%的置信區(qū)間(CI)是80-120(100±20)。如果計數(shù)200個精子，則SE為14(√200)其95%CI為172-288(200±28)。如果計數(shù)400個精子，則SE為20(√400),其95%CI為360-440(400±40)。條時為81.4-121條；一次計數(shù)10條時為4.80-18.4;一次計數(shù)1條時為表2.2參照精子計數(shù)總數(shù)的圓形樣本誤差(%)5123456789(廣西南寧第二醫(yī)院生殖中心劉峰)氏計數(shù)池的中央大方格（5號方格）容積是100nl，則其內的精子數(shù)目將是如2.4.2節(jié)中所述制作濕片并檢測其中之一，估框2.9池深為20μm的濕片中每高倍視野的容積2表2.3精液所需稀釋度、配制方法、使(μl）(μl）注4：如果1+19(1:20)稀釋不合注釋1：如果初始濕片制備中精子數(shù)目太低(每×400高倍視野<4：大約1×注釋2：為準確評估低密度精子（每×400將蓋玻片緊壓支持柱以固定于計數(shù)池上，可通過觀察兩層玻璃之間的虹彩將第一次稀釋的液體置于振蕩器以最高的速度振蕩10秒鐘以充分混勻，立注2：使用血細胞計數(shù)板夾保持蓋玻片位置不變將確保一個固定的池深每次至少重復計數(shù)200個精子以達到足夠低的抽樣誤差（請參閱框2.7和）；注1：如果在4、5和6號大方格中計數(shù)少于200個精子，不要繼續(xù)在1、2、和6號大方格(參閱2.7.2節(jié))。這種情況下，可降低框2.10重復計數(shù)的比較二次計數(shù)時在7行內發(fā)現(xiàn)有245個精子，總計數(shù)是在1），），例4：1+4(1:5)稀釋下，第一次計數(shù)時在4行內發(fā)現(xiàn)有），例5：1+4(1:5)稀釋下，第一次計數(shù)時在8行內發(fā)現(xiàn)有數(shù)時在8行內發(fā)現(xiàn)有213個精子，總計數(shù)是16行內有437(2241+4(1:5)稀釋下樣本的精子濃度為C=(N/n)×（6.825個精子/nl或6.8×=27.3/4=6.8×106/ml。），初始濕片制備中如果每高倍視野的精子數(shù)目稀少(即400倍數(shù)下0～4個精子子密度為2×106/ml（考慮到與稀少精子相關的高樣本誤差）及注明是否看到活混勻精液樣本（參閱框2.3）。如果樣本粘稠度高，有序的逐個視野掃視整個蓋玻片區(qū)域。從一個角落開側，然后沿y軸移動一個視野并以整個視野寬度向回返方向間。確定數(shù)量，請參閱2.11.1節(jié)或2.11.2節(jié)。有序的逐個視野掃視整個蓋玻片區(qū)域。從一個角落開側，然后沿y軸移動一個視野并以整個視野寬度向回返方向使用×20的物鏡和孔徑為20mm的×10目鏡時，本節(jié)描述采用非離心法計數(shù)稀少精子。以低倍稀釋精液進行檢測，或者加為了減少抽樣誤差，精子計數(shù)的數(shù)量必須達到一定的標準（最好重復計數(shù)框2.11改良紐鮑爾氏計數(shù)池全部9個大方格的計數(shù)精子達到200條改良紐鮑爾氏計數(shù)池全部9個大方格的容積5、每次重復計數(shù)至少200條精子，以獲得足夠低的抽樣誤差（見框2.7及6、對其中一個計數(shù)池逐個方格進行檢測，直到計夠200條精子和完整的一7、記錄精子計數(shù)達到200條時的方格數(shù)量。另一計數(shù)池計數(shù)精子時也要檢9、切換至另一計數(shù)池，重復計數(shù)與第一次相同的方格數(shù)（相同體積），即可接受性(兩者均顯示在95%的可信區(qū)間內，單純抽樣誤差允許的兩個數(shù)值的最當計數(shù)池的九個大方格都進行檢測時，每μl精子密度計算為：精子總數(shù)除當計數(shù)池的九個大方格都進行檢測時，每μl精子密度計算為：精子總數(shù)除/ml；這是在1:2樣本稀釋下對改良紐鮑爾氏計數(shù)池全部九個大方格計數(shù)時，抽例1：1+1（1:2）稀釋下，第一次重超出了偶然概率所允許的差異值（42因此需要例2：1+1（1:2）稀釋下，第一次重復計數(shù)時3個方格的精子數(shù)量為2第二次重復計數(shù)時3個方格的精子數(shù)量為200，6個方格的精子總數(shù)為410），例3：1+1（1:2）稀釋下，第一次重復計數(shù)時全部9個方格的精子數(shù)量是），當計數(shù)池的九個大方格（1.8μl)都進行檢測時，1+1（1:2）稀釋下樣本的精子例4：1+1（1:2）稀釋下，第一次重復計數(shù)時全部9個方格的精子數(shù)量是因此精子密度<56000/ml；檢測報告為“檢測精液樣本中可見1使用大容量、池深為100μm的計數(shù)板可增加精子密使用含有Hoechst33342雙苯甲亞胺熒光素(1毫克/升)的固定劑(參見在初始的濕片制備中，1+1(1:2)稀釋精液每高倍視野的精子數(shù)少于2條對精框2.12一次性大容量計數(shù)板的計數(shù)精子達到200條3、將計數(shù)板平放置于濕盒內（例如放在浸透水的過濾紙上并蓋上皿）以免5、每次重復計數(shù)至少200條精子，以獲得足夠低的抽樣誤差（見框2.7及6、對其中一個計數(shù)池有序的逐個視野進行掃視，從一個角落開始沿x軸以這種z形方式繼續(xù)掃視，當改變視野時要保持對計數(shù)板的檢測，直到計數(shù)達7、記錄精子計數(shù)達到200條時的視野數(shù)量。另一計數(shù)池計數(shù)精子時也要檢9、切換至另一計數(shù)池，重復計數(shù)與第一次相同的視野數(shù)（相同體積），即可接受性(兩者均顯示在95%的可信區(qū)間內，單純抽樣誤差允許的兩個數(shù)值的最×250放大倍數(shù)下，單個視野的容積是80nl（見框×400放大倍數(shù)下，單個視野的容積是20nl（見框2.13）。1+1(1:2)稀釋的精液，精子密度為C=（N/n）×（1/20）×2/nl，即C=（N/n）×當計數(shù)池的整個區(qū)域都進行檢測時，將精子總數(shù)除以兩個計數(shù)池的總體積框2.13池深為100μm的一次性大容量計數(shù)池每高倍視野的容積21+1（1:2）稀釋下樣本的精子密度為C=（N/n）×（2/v）/nl，如果v=20而第二次重復計數(shù)時整個計數(shù)池的精子數(shù)量為70，兩個計數(shù)池的計數(shù)精子總量），下樣本的精子密度為C=(N/50)×2/μl=(120/50)×2=4.8/μl,或4800/ml（就這因此精子密度<2000/ml。檢測報告為“兩次重復計數(shù)可見38條精子，因精子數(shù)S是該份精液的精子濃度(106/ml)，那么圓細胞濃度的計算公式是：C=S×(N/40時需報告計數(shù)細胞數(shù)目的抽樣誤差（見表2.2若計數(shù)的圓細胞數(shù)小于25，則例1：第一次重復計數(shù)時每200精子的視野內有21個圓細胞，而第二次重），例2：第一次重復計數(shù)時每200精子的視野內有24個圓細胞，而第二次重度是：C=S×(N/400)/ml，即C=70×106×（60/400）=10.5×106/ml（就這兩個有效數(shù)板，采用2.8.3節(jié)介紹的計數(shù)精子細胞的方法計數(shù)。但是，對于精另外，這些非精子細胞的密度可以通過計數(shù)過氧化物酶陽性細胞來評估（見形細胞密度（106/mlS為精子密度（106/mlN為計數(shù)400個精子相同視野25個，就單報告觀察的圓形細胞數(shù)量，并注釋“圓形細胞數(shù)量太少，無法進行精確計數(shù)”圓形細胞密度為C=S×（N/400）=70×（60/400）=10.5×106/ml。由于細胞計其是從性交后子宮頸管內粘液中獲得的精子（Fredricsson&Bjork,197;Menkveldetal.,1990以及從透明帶表面收集到的精子（Menkveldetal.,1991;Liu&得妊娠間期（time-to-pregnancyTTP）以及體內、體外妊娠率）之間的關系為0～30%,很少超過25%(Menkveldetal.,2001)。因此，正常值下限很低。在關于體外受精(Coetzeeetal,1998)、宮腔內人工授精((a,b)在體外從透明帶中回收的精子，用Shorr染色法染色。(c)性交后(a,b)由歐洲人類生殖和胚胎學協(xié)會授權，從Liu等(2003)處復制。2.13.2精液涂片的制備●盡管保留了大量殘留胞漿，但是滲透壓敏感性胞漿小體消失 3．在玻片的邊緣加5～10μl精液，具體加多少取決于精子的密度。用另外果刮片用的玻片不是那種有白漆標記面的，那么每個邊緣都可以用以刮）：度低時效果很好，但對于特別粘稠的精液，這種方法不理想（見圖2.12和當精子密度低(<2×10/ml)、粘稠或雜質很多、或者需要做計算機輔助形當精子密度很低(<2×10/ml),需要濃縮精液標本：1.以600g離心10分鐘。4.盡可能獲得最高密度的精子，但也不要超過50×10/ml。5.以后按正常精液標本處理(見2.13.2高的標本可以參照液化不良的標本處理后進行涂片(見節(jié))或者進行洗雜質和大量顆粒狀物質(例如非常粘稠的標本)可以導致精子頭部堆聚，這1.在室溫下，將部分精液(0.2～0.5ml,取決于精子的密度)加入10ml生理鹽水(0.9g氯化鈉(NaCl)加入100ml純水)。2.800g離心10分鐘。）：80%乙醇中只需要10秒，而在空氣中干燥后再浸入50%乙醇就需要更長時間漁霸士染色相比，Shorr染色后所得到的精子正常形態(tài)率相似（Meschedeet2．Shorr溶液：購買制成品或者按照以下步驟制備：將4gShorr粉溶解于由于缺乏客觀性、理解上的差異以及外部質量控制評估的可操作性差（見7.13.2節(jié)評估精子形態(tài)有許多困難。這里推薦一種簡單的正常/異常分類：用肉眼計數(shù)異常精子的異常部位。當評估精子正常形態(tài)率時需要采用下述標準頭部在外形上必須是平滑的、弧度規(guī)則的、大體上為橢圓形。頂體部分必須沒有大的空泡，小的空泡不超過2個，空泡的面積不能超過精子頭中段必須是纖細的、規(guī)則的且長度與頭部相同。中段頭部的主軸相延續(xù)。胞漿殘余體只有在過多時（也就是說超過精子頭部畸形。注釋3：用計算機系統(tǒng)（重復測量的變異系數(shù)為2～7%）分析7得出的頭部大小數(shù)據(jù)為：長4.1μm，95%CI3.7～4.7；寬2.8μm，95%CI2.5~注釋4：用同樣的計算機系統(tǒng)分析74巴氏染色后的精子（在2.14.2節(jié)介紹的方長4μm，95%CI3.3～5.2；寬0.6μm，95%CI0.5～0.7。在學習區(qū)分各種類型精子（正常/臨界精子頭部和尾部，見1～12版以及它個空泡或者>20%頭部區(qū)域為未染色的空泡頂體后區(qū)有空泡，頂體區(qū)主段畸形：短，多尾，斷裂，光滑的發(fā)夾樣彎曲，成角彎折，寬度不規(guī)特征為精子有大量不規(guī)則的、能被染色的細胞漿成份，為精子頭部大小種現(xiàn)象。注釋2：胞漿小滴是滲透壓敏感性的，在正常空氣干燥的過程中容易被破壞j）細D過多的胞漿殘余體((陳國武)bacillibent雙ifPPOKnotassessedpinheadpolymorphpyriform厚空泡多于兩個空泡圖解1中精子形態(tài)學評估123456789圖解2圖解2中精子形態(tài)學評估123456789圖解310微米圖解3中精子形態(tài)學評估123456789圖解4圖解4中精子形態(tài)學評估123456789圖解5圖解5中精子形態(tài)學評估123456789圖解6圖解6中精子形態(tài)學評估123456789圖解7圖解7中精子形態(tài)學評估頭部外形其他頭部評估頸部評估尾部主段評估整體精子分類評估10微米123456789圖解8圖解8中精子形態(tài)學評估圖解9123456789圖解9中精子形態(tài)學評估圖解10123456789圖解10中精子形態(tài)學評估圖解1112345678910微米圖解11中精子形態(tài)學評估圖解12123456789圖解12中精子形態(tài)學評估123456789圖解1310微米123456789圖解14中細胞評估123456789為防止觀察區(qū)視野選擇的偏頗，應系統(tǒng)選擇涂片觀察區(qū)視野對可評估精子8．確定可接受的誤差，參見表2.1、圖A7.2、附錄7（反映兩次計數(shù)百分需要應用多鍵計數(shù)器，其中一鍵表示正常精子，另一鍵表示缺陷精子，上2．缺陷精子百分比為各種類型缺陷精子數(shù)除例：用6鍵計數(shù)器計數(shù)評估200個精子，其中42個精子被精子，158個鏡子被計數(shù)為缺陷精子。缺陷精子中，140個為頭部缺陷，102個精子被計數(shù)為正常形態(tài)精子，164個精子被計數(shù)為缺陷精子。缺陷精子中，122查表可知兩次計數(shù)樣本誤差為可接受范疇。第一次評估正常形態(tài)精子比例尾部缺陷精子比例為（30+22）/400=13%，帶胞漿小滴精子比例為（44+36）有時部分精子會有一些特異性結構缺陷。比如：頂體未發(fā)育導致的小圓頭如患者的精子全部表現(xiàn)為一種缺陷，那此患者通常表現(xiàn)為不育。這種情況巴氏染色精液涂片觀察白細胞和精子細胞、精母細胞還是有顯著差異的（見2.14.2節(jié)）。區(qū)分主要是以上幾類細胞著色、細胞的大小和形狀存在較大差異還有許多其它技術可以判定精液中白細胞群的數(shù)量。如比較流行的過氧化物酶染色鑒定多行核粒細胞特有的過氧化物酶，較適合初篩（Woff，1995；白細胞也可以通過費時并昂貴的免疫細胞化學方法來檢測評估，這種方法一般經過氧化物酶染色后的精液才行白細胞計數(shù)，染色后可以比較容易的這種方法可以很好的分辨帶分葉核的中性粒細胞和多核的精子細胞，多核精子細胞本身不含過氧化物酶（Johanlsson水和9.08gKH2PO4溶于1000ml純水。混合兩液，調pH值至6.0（大約12ml氧化物酶陽性細胞至少200個。陽性細胞(可能此計數(shù)方格過氧化物酶陽性細胞數(shù)不足200個)。10.查表得知可接受的樣本誤差率(見表2.5、圖A7.1、附錄7)。取樣重做兩張涂片重新評估(見框2.10)。13.計算每次射出精液過氧化物酶陽性細胞總過氧化物酶陽性粒細胞(標記為P,染為棕色),過氧化物酶陰性圓細胞(標評估每張計數(shù)池的9個計數(shù)方格后，過氧化物酶陽性細胞總數(shù)除以兩張計數(shù)池的總容積（1.8μl乘以稀釋比（10）也能得到精液中過氧化物酶陽性細胞如每張計數(shù)池中過氧化物酶陽性細胞數(shù)少于25個，密度＜277000/ml；應用改良紐鮑爾計數(shù)池，按1:10稀釋后，評估所有9個計數(shù)方格的誤差下限為表2.5查得樣本誤差超出隨機誤差（24故本次結果不可取，需重新涂片計數(shù)例2：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察5個計數(shù)方格發(fā)現(xiàn)204個過氧化物酶陽性細胞，涂片2觀察5個計數(shù)方格發(fā)現(xiàn)198個過氧化物酶陽性細胞。10個觀例3：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察9個計數(shù)方格發(fā)現(xiàn)144個過氧化物酶陽性細胞，涂片2觀察9個計數(shù)方格發(fā)現(xiàn)162個過氧化物酶陽性細胞。18個觀察計數(shù)方格過氧化物酶陽性細胞總數(shù)306個（144+162樣本誤差為18例4：1:10稀釋后涂片，涂片1觀察9個計數(shù)方格未發(fā)現(xiàn)過氧化物酶陽性細胞，涂片2觀察9個計數(shù)方格發(fā)現(xiàn)少于25個過氧化物酶陽性細胞，密度＜277000/ml；報告時應注明“細胞數(shù)目過少，無法達到精確評估濃度細胞活性等(Tomlinson等,1993;Aitken和Baker,1995;Rossi和Aitken,1997)?？赏ㄟ^巴氏染色將精子和精原母細胞與白細胞區(qū)分開來(Johanissonetal.,內白細胞過氧化物酶、無白細胞特異性抗原(見3.2節(jié))多核精子細胞與多核白細胞在形態(tài)上難以區(qū)分。但染色后精子細胞呈淡紅色而PMN白細胞呈藍色(Johanissonetal.,2000)?？梢罁?jù)發(fā)育中頂體的特異性染色(Coutureetal.,1976)、凝集素（見4.4.1節(jié)）和特異的抗體（注釋2：僅有少量抗精子抗體的存在不能作為診斷精子自身免疫疾?。╯perm集試驗（MAR綜述見Bronsonetal.,1984）免疫球試驗（IBBronson洗滌后的精液。兩種檢測方法不一定能得到相同的結果（Scarsellietal.,1989而對于那些沒有活動精子的標本，體有足夠的相互作用時間。因為至少需要10分鐘的反應時間才能觀察到混力。此外，將精子與已知含有抗體的精漿共孵育也可得到用做對照的陽性精子4.將3.5μl含有包被有IgG的膠乳顆粒（小珠）的試劑分別加待測標本及對照5.將3.5μl含有包被有IgG抗血清試劑分別加待測標本及對照物中，并用加樣不用10分鐘時重復觀察。觀察。注釋：當50%或更多的活動精子被小珠粘附時精子宮頸粘液穿透能力和IVF受這項檢測比MAR費時，但IB中精子經過洗滌，除去了精漿中可能對檢測在直接免疫珠試驗（IB）中，共價連接有兔抗人免疫球蛋白IgG/IgA的小3.緩沖液II：加入5克CohnFractionVBSA至100ml杜氏（Dulbecco4.使用0.45-μm孔徑的濾膜過濾上述-在每個檢測中，必須同時含有ASAb-陽性的精子和ASAb-陰性的精子作為對照。上述精液必須來自已被之前的直接免疫珠試驗證明含有/未含有抗精抗體8.只計數(shù)被一粒或多粒免疫珠結合的活動精子。參見節(jié)，忽略尾尖被如果待測體液是宮頸粘液，需準備濃度為10IU/ml的菠蘿蛋白酶(EC2.將溶解的宮頸粘液、血清、精漿或睪丸液56性時，可用作陽性質控標本的來源。（陽性是指>50%的活動精子被粘附，的百分率更有意義；特別是當涉及研究人類生精功能損傷情況時(Jouannetetal.,評價一些病理或有毒有害環(huán)境對生育力影響時也十分有用(Augereta頭部的1/3時）幾個方面來評價精子是否存在缺陷。使用細胞計數(shù)器進行計數(shù)。計算在內。與本手冊的其它評價體系不同(見2.15.1節(jié)和2.15.2節(jié))，該指數(shù)所使用的形態(tài)評價標準應采用由David等（1975）提出，經Auger和Eustache43人類生殖與胚胎手冊（EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology，ESHRE）以及北歐男科學會（NordicAssociationforAndrology，NAFA)(ESHRE/NAFA,2002)。與本手冊之前的版尾部缺陷，44條有多余的胞漿小滴殘留。在第2次計數(shù)時，36條正常，164條時，用總的畸形數(shù)(140+102+30+44+122+108+22+36=604畸形)除以異常精子數(shù)MAI15N2.Menkveldetal.,23.Jorgensenetal,2001,使用的是David形態(tài)分類法(Davidetal.,1975,由Auger已經釋放了粒細胞的多形核白細胞和不含過氧化物酶的其它類型的白細胞如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞不被為o-甲苯胺細胞過氧化試驗檢測出來。2.Tris-緩沖液（TBSpH8.2；見Appen甲基甲酰胺以及0.1ml1.0mol/l的左旋咪唑。使用前加入10mg快紅（fast9.Harris’s蘇木精染液（作于復染見Appendix4,sec1.分別在兩張清潔的玻片上滴加5μl精子懸液并制成涂片(見Section2.13.2)并1.用×200或×400倍的明場顯微鏡檢查整個染2.為了將誤差控制在可接受的范圍內，每次須至少計數(shù)200條精子。同時記紅色是含有CD45的細胞(白細胞)如果在樣本中含有的CD45-陽性細胞比精子少(如<400),則樣本的誤差將超過5%。此時，需要報告計數(shù)的細胞數(shù)的誤差(見表2.2)。如果計數(shù)的CD45-陽性細胞數(shù)少于25,報告觀察到的CD45-陽性細胞數(shù)并例1:在一次檢測中，在200條精子中有20個CD45-陽性細胞；在二次檢測中，在200條精子中有40個CD45-陽性細胞。則總數(shù)(20+40)是60,誤差(40-20)是20。從表2.5中可以看到超過了隨機誤差(15),因此該結果不被接例2:在第一次檢測中，每200條精子中有25個CD45-陽性細胞；在二次檢測中，在200條精子中有35個CD45-陽性細胞。則總數(shù)(20+40)是60,誤差是10×10/ml(保留兩位有效數(shù)字)。由于計數(shù)到的細胞少于400個，則根據(jù)表躍精子的數(shù)目，評估精子存活數(shù)目（Sobrero&MacLeod，1962）和精子的活動框3.1石蠟油混合物的制備器提取。精子在陰道內兩個小時就會失活。觀察陰道中精子涂片的目的(參見2.4.2穿過宮頸粘液的精子數(shù)目的評估一般采取計數(shù)高倍鏡視野下所見精子數(shù)目●排除其它明顯的性交后宮頸因素，如果在性交后9-14小時內沒有在宮頸粘液使用體外試驗對精液-子宮頸粘液相互作用予以詳細的評估。通常，當性交子能夠活動和存活的最適pH值范圍為7.0—8.5，這也是月經中期宮頸粘液pH3.水平地存放載玻片在30分鐘在37°C在一個濕潤的溫箱(即在一個有蓋的種物理特性，不含有精子的精液也會發(fā)生(Perloff和steinberger1963;Moghissi4.精子的移動距離可以達到至少500μm(即大約為10個精子長度)，即離開因為在平面的玻片上使得精液-宮頸粘液接觸界面的大小和形狀完全標準化是不可能的，故該試驗的結果時常帶有一些主觀性。因此，精液-宮頸粘液互作毛細管測試最初是由Kremer設計的(1965),本法是在一毛細管內測量精子定在離儲液囊5mm的位置。這種構造可以防止精液侵入毛細管和玻璃片之飽含水分的濾紙)防止精液和粘液變干。6.如節(jié)所述，觀察毛細管應在放大×100的顯微鏡下。7.設備置于37℃孵化器，且在24個小時后為了觀察前向運動的精子的表現(xiàn)，應該重復檢查毛細管。在2個小時以后，評估遷移距離、穿透密度、遷移所導致的精子減少數(shù)目和前向運動精子的數(shù)目。1.遷移距離：測量所浸入精液儲液槽的毛細管末端到管中最前面的精子之間2.穿透密度：在距浸入精液儲液槽內的毛細管末端1cm和4.5cm的兩個點處測定。由每低倍鏡視野(×100LPF)下觀察到的每個距離點的精子平均數(shù)決定。通過計數(shù)五個低倍鏡視野而獲得平均數(shù)。計數(shù)均值用穿透密度等級來表示，如表3.3所示。對于測試的分類，以1或4.5cm的距離下最高的精子穿入密度等級作為檢驗的結果。表3.3精子穿透密度排行次序穿透密度的分類排列順序012345673.遷移減少：通過計算4.5cm處穿透密度較1cm處的減少量來獲得。以不同等級序號表示。例1:在1cm處的穿透密度是51-100/LPF,而在4.5cm處是6-10/LPF。則遷移減少值是3(等級序號6減去3)(表3.3)例2:在1cm處的滲透密度是21-50/LPF,而在4.5cm處是51-100。則遷移值減少價值是零，因為其穿透密度沒有減少，實際上是增加了(表3.3)。10--或或或2差和和和好所有不能分級的試驗結果總結為現(xiàn)有多種反映附屬性腺功能的生化指標，如前列腺分泌的檸檬酸、鋅、γ-●前列腺的分泌功能。精液中的鋅，檸檬酸(M?llering和gruber，1966)或酸性●附睪的分泌功能。L-左旋肉毒堿，甘油磷酸膽堿（GPC）和中性α-葡糖苷酶是臨床常用的附睪標志物。在精漿中存在兩種α-葡糖苷酶的異構體：其中主要來源于前列腺。在反映附睪功能失調方面，中性α-葡糖苷酶較左旋肉毒堿和甘這種方法需要使用一個精確度為4μmol/l的96孔板測定儀(Cooper等，1991)。當分光光度儀使用3ml或1ml的比色杯時，可以按比例調整精液和試劑的體積化合物2-（5-溴-2-吡啶偶氮）-5-（N-丙烷-N-磺基丙氨）-苯酚(5-Br-PAPS)3.標準曲線：按照步驟2所述，溶解101.將精液分析后的剩余精液以1000g離心10分鐘，收集無精子的精漿于-20°C儲存待分析。無精子精漿可以合并以其它樣品為以后內部質量管理分析用4.向96孔讀數(shù)板中加入步驟3中的雙份稀釋的精漿標本各3.結果需乘以稀釋倍數(shù)61（5微升精漿以300微升水稀釋以獲得未稀釋4.兩組之間的差異應在10％以內，即（估值/估值的平均數(shù)間的差異）×5.乘以一次射精的精液體積，得到每次射出的精液中鋅濃度（毫升進而每次射精中的鋅的參考低值為2.4μmol/次（來自于庫珀等，1991；和TG1.脫蛋白質的試劑1(63μmol/l的ZnSO4)：在100ml凈化水中溶解1）：哚溶解其中，并加凈化水至100ml。過濾器（0.45微米孔徑）過濾后于4°C下4.果糖標準液（2.24mmol/L）：在1.將精液分析后的剩余精液以1000g離心10分鐘，收集無精子的精漿于-20°C儲存待分析。無精子精漿可以合并以其它樣品為以后內部質量管理分析用4.脫去蛋白質：向稀釋的樣品55μl中加入加12.5μl濃度為63μmol/l的7.加0.5ml的濃(32%v/v)鹽酸(HCl)到每個樣品中，加蓋自封口磨砂實驗室3.結果應乘以每個樣品的稀釋倍數(shù)16（5微升精漿加入75微升的水和沉淀4.兩組之間的差異應在10％以內，即（估值/估值的平均數(shù)間的差異）×5.乘以一次射精的精液體積，得到每次射出的精液中鋅濃度（毫升進而精液中含有兩種α-葡萄糖苷酶同工酶，其中一種萄葡糖苷酶可將合成的吡喃葡萄糖苷底物轉化為在碳酸鈉條件下呈現(xiàn)黃色精液中附睪分泌的中性α-葡萄糖苷酶的測量試劑盒是可以通過商業(yè)途徑得到的。只推薦使用包括SDS和澳栗精胺的試劑盒來進行該項精液中的酶檢驗。6.用于空白對照的葡萄糖苷酶抑制劑（奧粟精胺，10mmol/L）：在10毫升的凈化水中溶解18.9mg的澳栗精胺，稀釋10倍，即加純凈水稀釋成11.以1000g離心精液分析后的剩余樣品10分鐘，收集無精子的精漿于-20°C儲存待分析。無精子精漿可以合并以其它樣品為以后內部質量管理分析用4.向其中兩份含質控樣本中加入8μl濃度為1mm3.乘以修正系數(shù)（0.6194，見注）以獲得未稀的精漿樣本中的中性葡萄糖苷4.從每個待測樣本中減去經奧粟精胺處理的精漿空白對照組（IU/l）的活性5.兩組之間的差異應在10％以內，即（估值/估值的平均數(shù)間的差異）×6.乘以一次射精的精液體積（ml得到每次射出的精液中葡萄糖苷酶的總特別是使用DNA熒光染色和尾部檢測計數(shù)法，已可進行精子密度的測定精率和受精時間有很好的相關性(Liue用CASA分析精子運動參數(shù)時，每個標本中至少性和密度。檢測精子活動力，標本密度應控制在2×106/具有高密度(如高于50×106/ml)精子的2、用無精子的精漿稀釋原精液樣本至其密度低于50×1數(shù)池均應被充滿并檢測。必須檢測幾個有代表性的視野野（共12個視野）以得到可靠的結果。每個計數(shù)池至少應2、VSL=直線速度(μm/s)。根據(jù)精子3、VAP=平均路徑速度(注：不同的CASA儀器用不同的數(shù)學運算方法計算多項運動參數(shù)。目前所有應用熒光DNA染色CASA可準確檢測活動精子的密度以及活動力的百分比，但需謹慎應用該技術(Garrettetal,2003)。例如，如果使用一次性計數(shù)池，因為精子充滿計數(shù)池時分布會不均勻，故評估不同位置的精子標本是重要的(Douglas-Hamiltonetal.,2005b)。應用血細胞計數(shù)板驗證是必要的。密度在50×106/ml以上的需要稀釋(見35.2.2小節(jié))。方法知道精子是否完整(如頭尾相粘)。3.5.4計算機輔助精子形態(tài)學評估圖像分析在評價精子形態(tài)方面，可能帶來量化、客觀性和可重復性的重大進展。商業(yè)系統(tǒng)可用來量化精子頭部和中段的形態(tài)，主段精子也有可能。然而，精子尾部缺陷對運動的影響可以更直接地通過應用CASA檢測活動力和運動狀態(tài)。CASA系統(tǒng)通?？梢詫⒕宇^和中段分為正常或異常，并且給出精子頭和中段、頭部橢圓和規(guī)則性以及依賴染色檢測的頂體區(qū)的平均值和標準差或中位數(shù)。術人員的手動評估。計算機輔助精子形態(tài)學評估（CASMA）結果的重現(xiàn)性和準的影響。如果精子密度低（<2×106/ml需要離心濃縮標本，如2.13.2分比及直線速度（VSL與大樣本的低生育力夫婦的自然妊DNA致密性和完整性在確定人類精子功能活性方面的重要性。新出現(xiàn)的證據(jù)建議將精子DNA完整性及染色質組織與生育力聯(lián)合起來考慮。Aitken&Krausz,2001;Virroe程的能力，如精子-卵子透明帶結合試驗，頂體反應試驗以及與卵母細胞卵黃膜細胞質內存在高活性的細胞質酶，如肌酸磷酸激酶。(Raoetal.,1989;Gomezet 在人類射出的精液中，活性氧類物質是由精子(Aitken&Clarkson,1987;的。精漿中有抗氧化物清除劑和酶，某些男性的這些物質可能不足(Jonesetal.,能使精子更易受到氧化損害。生成高濃度的ROS可能引起過氧化損害和精子功此程序需要使用一個靈敏的照度計來檢測存在化學發(fā)光探針，如魯米諾或合物，從而能夠敏感地檢測到過氧化氫的產物。然而，也可以用其它探針（如lucigenin）來檢測洗滌后的人精子產生的活性氧類物質（ROSAitkenetal.,formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(FMLP)產生的化學發(fā)光信號對白細胞群是注釋1：這些探針測定精子活力的精確性還是一個有爭議的問題(Aitkenetal.,）：4．辣根過氧化物酶（HRP）(VI型，310IU/mg蛋白)：5mg(1550IU)溶于13．吸取400μl洗滌的精子懸液加入無酚紅的KRM混懸，后加入一個一次性照通過添加FMLP、酵母多糖或PMA刺激精液白細胞產生的ROS，而PMA加入20μl調理的酵母多糖至上述標本，以刺激存在于精子懸液內每個白細胞產生化學發(fā)光信號。產生化學發(fā)光信號的大小直接與混入白細胞的水平成比例(見圖4.1)。PMA誘導白細胞和精子產生ROS試驗1.用DMSO以1:100的比例將PMA原液稀釋成10μmol/l工作液。2.等待至FMLP或調理的酵母多糖的信號消退。3.加4μl的10μmol/lPMA于等量的精子懸液中(終濃度為100nmol/1),刺激精子產生化學發(fā)光信號(見圖4.2)。圖4.2細胞懸液產生活性氧能力與白細胞和精子亞群的關系(a)在存在白細胞污染的情況下，加如白細胞特異探針FMLP后，產生一個ROS峰。繼之加入PMA,精子和白細胞群產生一個持久的強化學發(fā)光信(b)如果沒有白細胞污染，F(xiàn)MLP反應則消失，而PMA引發(fā)一個顯著的由精子產生的化學發(fā)光信號(也見于Krauszetal.,1992)。一種稱作半卵透明帶測定法的透明帶結合試驗(Burkmanetal.,1檢測精子用一種標記物染色(如熒光素),而對照精子用另一種標記物染色(如應能通過從透明帶表面去除的精子或人透明帶分解的蛋白來評價(Liu&Baker,如鈣離子載體可誘發(fā)頂體反應，但是結果不如由透明帶誘發(fā)的頂體反應(Liu&Baker,1996)。頂體反應后的頂體狀態(tài)可通過顯微鏡或流式細胞儀檢測(Fenichel2．頂體反應(AR)：精子在赤道段僅有一個熒光帶，或者在頂體區(qū)無熒光著色。2.每張載玻片檢測200條精子，可獲得較低的采樣誤差。頂體反應(AR)是精子與透明帶結合之后，發(fā)生在細胞外的過程，它一定1.含3.5%(35g/l)人血清白蛋白(HAS)的Ham·sF-10培養(yǎng)液(見附錄4,A4.44．應用Ham,sF-10-HAS2．為確保每次新配制的染料配制適當，必須用舊人精子與倉鼠卵母細胞融合的過程在功能上同與人卵母細胞融合的過程是繼精子-透明帶之間的相互作用后，引起頂體反應的細胞內信號是鈣內流和胞漿堿化，兩者均可由二價陽離子載體A23187人工誘發(fā)。另一種方法是使用次性吸頭吸取已經預溫并在CO2孵箱中平衡好的礦物油覆蓋液滴，小心操作不5．計數(shù)精子密度（見2.7和2.8節(jié)）,用新鮮配制的BWW液將活動精子密框4.1倉鼠誘導排卵確保注射活體動物的流程都符合法律程序。準備好合適劑量的孕馬血清射30單位PMSG給未成熟倉鼠或動情期第一天的成熟倉鼠。48-72小時后，經7．持住子宮最遠端的位置，緊貼鑷子下方從子宮末端切斷5．室溫下，用1%胰酶（10000IU框4.2玻璃吸管的制備胺藍)或核酸(吖啶橙，色霉素)結合的染料，之后用組織行評估。新方法包括一些可以評估DNA斷裂程度的試驗，如TdT介導的dUTPDNA末端標記法(TUNEL(原位末端標記，ISEL),彗星實驗以及精子染色質時也與精子形態(tài)、活力和活率相關。這些試驗可為預測標準IVF的授精率提供本圖片經SpringerScience+BusinessMedia授權，摘自Aitken等(1983)。顯得非常重要。直接用培養(yǎng)基稀釋精液后離心仍是IUI富集精子常用方法(Boomsmaetal.,2004)，但對于一些有一個或幾個參數(shù)異常精液，密度梯度離心液標本，玻璃絨柱法可以取得與密度梯度離心法相同的效果(Rhemrevetal.,精液的參數(shù)決定應該選擇何種精子制備方法(seeCanaleetal.,1994)。直接回收率低小于20%，而密度梯度離心回收率高大于20%。這兩種方法獲得的精分鐘。根據(jù)精子的游動能力即能游出精漿游進培養(yǎng)基來少，但在需要活動精子量較少的IVF或ICSI技術中，這種所以在配制成精子處理培養(yǎng)基時必須需要調配到與女合應用上游法和密度梯度法進行精子制備能夠保該進行RT-PCR檢測，只有未被感染的切開活檢（用或不用顯微操作）和經皮穿刺活檢都力下離心8分鐘。離心后的逆行射精樣本和正對于不能射精或者射精障礙的病人，可以通過對陰精子冷凍保存是男科實驗室工作中的一個重要組子免受冷凍損傷，可以將人類精子冷藏在–79℃的干冰上(Polgeetal.,1949;Bunge&herman,1953;Bungeetal.,1954)。隨著液氮廣泛應用，人類精子冷凍貯凍存時間的延長而下降。冷凍保存超過28年的精子），供精生育力保護不孕癥治療材料程序。在棉花和羊毛之間有若干聚乙烯乙醇粉末塞子的試2．最常用的程序是按照每分鐘1.5℃的速率從20℃降到–6部的液氮蒸氣和空氣的混合氣體內籃子放置10-1加大精子的檢測數(shù)量當然可以降低計量誤差（見表2.2、方框2.5和2.7框7.1質量保證和質量控制術語真正的價值估計，往往源于數(shù)個實驗室的平均結果（目標一個對指定值測試結果的偏差。這是在同一方向（系統(tǒng)誤observationsagainsttheirm一個自然變異，影響這一進程的所有個人價值的來源正在一個時間序列圖顯示的一系列個人測量，包括中間線和控國際標準化組織一個設定國際化標準的機構，包括實驗這與計算數(shù)字的平方根成反比。抽樣誤差SE）是在一定時間內測量值的控制圖，它用于監(jiān)控錯誤的可能性也越小。對IQC或者IQC材料進行監(jiān)控的一種實用方法是使用質量控制圖。這樣就可以根據(jù)當?shù)貥藴拾袸QC也成為實驗室常規(guī)質控的一部分。），A7.7提供了如何評估質量控制涂片的形態(tài)方法。如果涂片準備和儲存得當，可錄影標本的磁帶，CD或DVD，無論是從實驗室還是EQ固定厚度，這是30分鐘的穩(wěn)定，也可使用（sofixed-depthchambers,whichareXBAR的圖表的主要目的在于發(fā)現(xiàn)檢測結果的誤差，或者不同的變異全面增新樣本材料應該和前期的10份樣本一起建立新的Xbar質控范圍員值23456789下表顯示了4名技術人員對來前10個QC樣品的精子密度測定值，以及每個樣樣品:12345678938平均差(Sbar)是:(3.27+3.70+...+3.74)/10=3.40。從見表7.1中可以得出，樣本距離均值2個標準誤）為:Xbar±A2,n×Sbar=39.7±(1.085×3.40)者36.0和43.3×106/ml。同樣可以得出外控制線:Xbar±A3,n×Sbar=39.7±圖中（7.1）就可對將來的QC樣本值進行圖表中(

)為連續(xù)測量的平均值，圖表顯示檢測值、警戒限和處置限。別突破5%和0.2%,成為為未來樣本的一個隨機單獨變量。這些限制由x2分布從表7.2來看，Sbar平均樣本標準偏離是3.40×106/ml,從表7.1來看對于n為4的最低處置值是sa,n。失控(見7.8節(jié))。某個百分比例p的標準差的估計值為p(100-p)/N(如果百分比在20%-80%之間變化),(朱曉斌)1.單點在3倍標準差范圍外，這是個被普遍認可簡單的規(guī)則，表明在過程中6.連續(xù)8個點都在中心線的同一側，這條規(guī)則很具吸引力，因為其簡單適用在操作中，從第一條到最后一條都是被普遍認可的，如果某QC樣本值被判定為“不合格”,其敏感度警示能給出誤差的不同類型(隨機性或系統(tǒng)性),從而框7.50C圖的基本控制原則框7.50C圖的基本控制原則1.樣本混勻不足(常見粘稠或凝集);2.技術員緊張(計數(shù)不穩(wěn)定或記錄錯誤);這些識別問題的過程，設計和測試1個假使用新鮮標本進行測定的QC程序類似于采用儲存的樣本，并允許技術員之圖7.3人工和計算機輔助精液分析精液分析)/2結果均值的差異點圖。均值(%)數(shù)據(jù)由HWGBaker提供2.計算均值和標準差的差異，由于同份標本被2位技術員分析，之間均值差異應為零，由零的任何顯著性差異，需配對進行t-檢驗，發(fā)現(xiàn)這2位技術員間的偏差(系統(tǒng)差異)。3.針對兩份標本每次檢測結果繪圖(Youden繪),比較幾位技術員對濃度的測定，每次檢測2個單獨的標本，類似如圖7.4。每個技術員(稱為IQC)或每個實驗室(稱為EQC),每次兩個標本測量值均繪制。橫向虛線和垂直虛線是有經驗技術員(IQC)或實驗室(EQC)測定結果95%可信限。有效值均落在這些虛線交匯的范圍內。標1顯示隨機誤差即1份標本測定值在有效范圍內而另1份不在，當系統(tǒng)誤差即2份標本測定值都太高(右上角標2)或都太低(左下角標2)。1份標本測定值太高或另份測定值太高的隨機誤差(標3)。圖7.4Youden繪精子密度評估圖由多位技術員分析2份精子標本，對每次檢測結果標繪，每個技術員(或實驗室，EQC)的結果用不同符號和顏