NGS二代測(cè)序培訓(xùn)

NGS二代測(cè)序培訓(xùn)演講人：2024-07-09FROMBAIDUNGS二代測(cè)序技術(shù)概述NGS實(shí)驗(yàn)操作流程與技巧數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與解讀方法論述生物信息學(xué)在NGS數(shù)據(jù)分析中應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室安全與法規(guī)遵守要求說(shuō)明實(shí)際操作演練與問(wèn)題解答環(huán)節(jié)目錄CONTENTSFROMBAIDU01NGS二代測(cè)序技術(shù)概述FROMBAIDUCHAPTERNGS技術(shù)原理簡(jiǎn)介高通量測(cè)序利用芯片進(jìn)行測(cè)序，可以在數(shù)百萬(wàn)個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測(cè)序，從而實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序，使得測(cè)序速度和通量大大提升。數(shù)據(jù)產(chǎn)出與分析測(cè)序完成后，會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，需要利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和解讀，包括質(zhì)量控制、序列比對(duì)、變異檢測(cè)等步驟。邊合成邊測(cè)序通過(guò)捕捉新合成的末端的標(biāo)記來(lái)確定DNA的序列，特有的技術(shù)體系包括可逆終止子、DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的dNTP。030201NGS技術(shù)起源于上世紀(jì)90年代，經(jīng)歷了從第一代到第二代的跨越式發(fā)展，測(cè)序通量和速度得到了極大的提升。技術(shù)起源與早期發(fā)展目前市場(chǎng)上主流的NGS測(cè)序平臺(tái)包括Illumina、ThermoFisher等，它們各自具有獨(dú)特的技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前主流平臺(tái)與技術(shù)特點(diǎn)隨著NGS技術(shù)的不斷進(jìn)步，測(cè)序成本逐漸降低，同時(shí)數(shù)據(jù)產(chǎn)出和分析也面臨著更大的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。技術(shù)進(jìn)步帶來(lái)的挑戰(zhàn)與機(jī)遇發(fā)展歷程及現(xiàn)狀應(yīng)用領(lǐng)域與市場(chǎng)需求基礎(chǔ)科研領(lǐng)域NGS技術(shù)在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳學(xué)等基礎(chǔ)科研領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，為科學(xué)家提供了前所未有的研究手段。臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域其他應(yīng)用領(lǐng)域NGS技術(shù)在疾病診斷、精準(zhǔn)醫(yī)療和藥物研發(fā)等臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，為個(gè)體化醫(yī)療的實(shí)現(xiàn)提供了有力支持。此外，NGS技術(shù)還在農(nóng)業(yè)育種、生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)本次培訓(xùn)，使學(xué)員全面了解NGS二代測(cè)序技術(shù)的原理、發(fā)展歷程、應(yīng)用領(lǐng)域及市場(chǎng)需求，掌握基本的測(cè)序數(shù)據(jù)分析和解讀能力，為今后的科研或臨床工作打下基礎(chǔ)。培訓(xùn)目標(biāo)本次培訓(xùn)將圍繞NGS技術(shù)原理、測(cè)序平臺(tái)與操作流程、數(shù)據(jù)產(chǎn)出與分析方法、應(yīng)用領(lǐng)域與前景等方面展開詳細(xì)講解，并結(jié)合實(shí)踐操作和案例分析，使學(xué)員能夠?qū)W以致用。內(nèi)容安排本次培訓(xùn)目標(biāo)與內(nèi)容安排02NGS實(shí)驗(yàn)操作流程與技巧FROMBAIDUCHAPTER質(zhì)量控制對(duì)采集的樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，包括DNA/RNA的濃度、純度以及完整性等，以確保樣本質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。樣本采集根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，采集適當(dāng)?shù)臉颖?，如血液、組織等，并確保采集過(guò)程中避免污染。樣本保存與運(yùn)輸采用適當(dāng)?shù)谋４娣椒?，如低溫保存，并確保在運(yùn)輸過(guò)程中樣本的完整性和穩(wěn)定性。樣本準(zhǔn)備及質(zhì)量控制方法文庫(kù)構(gòu)建原理掌握文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中的關(guān)鍵步驟和操作技巧，以提高文庫(kù)構(gòu)建的成功率和質(zhì)量。文庫(kù)構(gòu)建操作技巧質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)了解文庫(kù)質(zhì)檢的方法和標(biāo)準(zhǔn)，包括濃度、片段大小分布等，以確保文庫(kù)質(zhì)量滿足測(cè)序要求。了解不同NGS平臺(tái)的文庫(kù)構(gòu)建原理，包括片段化、末端修復(fù)、加A尾、連接接頭等步驟。文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)介紹儀器準(zhǔn)備檢查測(cè)序儀的狀態(tài)，確保其正常運(yùn)行，并進(jìn)行必要的維護(hù)和保養(yǎng)。試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備測(cè)序所需的試劑，如測(cè)序引物、酶等，并確保其質(zhì)量和濃度符合要求。樣本加載按照測(cè)序儀的要求，正確加載待測(cè)樣本，并設(shè)置適當(dāng)?shù)臏y(cè)序參數(shù)。注意事項(xiàng)在測(cè)序前，應(yīng)仔細(xì)檢查所有步驟是否按照要求完成，以避免測(cè)序失敗或數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳。上機(jī)測(cè)序前準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng)數(shù)據(jù)下機(jī)后初步處理流程數(shù)據(jù)下載與解壓從測(cè)序儀上下載原始數(shù)據(jù)，并進(jìn)行解壓操作，以便進(jìn)行后續(xù)分析。數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，包括讀取質(zhì)量、堿基質(zhì)量等，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。數(shù)據(jù)過(guò)濾與修剪根據(jù)質(zhì)量評(píng)估結(jié)果，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和修剪，以去除低質(zhì)量或不可靠的讀取。初步分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，如統(tǒng)計(jì)讀取數(shù)量、GC含量等，以了解數(shù)據(jù)的整體情況。03數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與解讀方法論述FROMBAIDUCHAPTER原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估指標(biāo)講解堿基質(zhì)量值（QualityScore）01講解如何通過(guò)堿基質(zhì)量值評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，包括Q20、Q30等質(zhì)量指標(biāo)的含義和重要性。測(cè)序深度（SequencingDepth）02介紹測(cè)序深度的概念及其對(duì)變異檢測(cè)準(zhǔn)確性的影響，探討不同測(cè)序深度下變異檢測(cè)的靈敏度和特異性。GC含量（GCContent）03分析GC含量對(duì)測(cè)序質(zhì)量的影響，以及如何根據(jù)GC含量調(diào)整測(cè)序策略以提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。重復(fù)序列（DuplicateReads）04解釋重復(fù)序列產(chǎn)生的原因及其對(duì)數(shù)據(jù)分析的影響，討論去除重復(fù)序列的方法和必要性。去除低質(zhì)量序列分享根據(jù)質(zhì)量值、測(cè)序接頭等信息去除低質(zhì)量序列的技巧，以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。校正測(cè)序錯(cuò)誤數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)清洗、過(guò)濾和校正技巧分享介紹使用工具對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行校正的方法，包括基于k-mer的校正、基于統(tǒng)計(jì)模型的校正等。講解數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理的必要性和方法，以確保不同樣本之間的數(shù)據(jù)具有可比性。變異檢測(cè)和注釋方法探討變異檢測(cè)算法介紹常用的變異檢測(cè)算法及其原理，包括基于貝葉斯模型的算法、基于啟發(fā)式搜索的算法等。變異注釋數(shù)據(jù)庫(kù)分享常用的變異注釋數(shù)據(jù)庫(kù)及其使用方法，如dbSNP、1000GenomesProject等，以幫助研究人員理解和解釋檢測(cè)到的變異。變異篩選和優(yōu)先級(jí)排序探討如何根據(jù)變異的類型、頻率、功能影響等因素對(duì)變異進(jìn)行篩選和優(yōu)先級(jí)排序，以便后續(xù)分析和驗(yàn)證。報(bào)告撰寫和結(jié)果解讀要點(diǎn)介紹NGS二代測(cè)序報(bào)告撰寫的規(guī)范和要點(diǎn)，包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、方法、結(jié)果、討論等部分的撰寫技巧。報(bào)告撰寫規(guī)范分析在結(jié)果解讀過(guò)程中常見的誤區(qū)和注意事項(xiàng)，以提高研究人員對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確理解和解釋能力。結(jié)果解讀誤區(qū)通過(guò)具體案例分析和討論，幫助研究人員更好地理解和掌握NGS二代測(cè)序數(shù)據(jù)的解讀方法和技巧。個(gè)案分析與討論04生物信息學(xué)在NGS數(shù)據(jù)分析中應(yīng)用FROMBAIDUCHAPTER生物信息學(xué)基本概念及常用工具介紹01綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)的知識(shí)，對(duì)生物數(shù)據(jù)進(jìn)行獲取、加工、存儲(chǔ)、分配、分析和解釋的科學(xué)。BLAST（序列比對(duì)工具）、Bowtie/BWA（短序列比對(duì)工具）、SAMtools（處理SAM/BAM格式數(shù)據(jù)）、GATK（基因組分析工具包）等。NCBI（美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心）、ENSEMBL（歐洲生物信息學(xué)研究所基因組數(shù)據(jù)庫(kù)）等。0203生物信息學(xué)定義常用生物信息學(xué)工具數(shù)據(jù)庫(kù)資源01基因組組裝將測(cè)序得到的短序列拼接成完整的基因組序列，包括重疊群（contig）構(gòu)建和支架（scaffold）構(gòu)建。基因組注釋識(shí)別基因組中的基因、轉(zhuǎn)錄本、重復(fù)序列等元素，并對(duì)其進(jìn)行功能注釋，包括基因預(yù)測(cè)、轉(zhuǎn)錄本識(shí)別、功能域分析等。常用軟件Velvet、ABySS等用于基因組組裝；GeneMark、GlimmerHMM等用于基因預(yù)測(cè)；BLAST2GO、InterProScan等用于功能注釋?；蚪M組裝和注釋原理講解0203差異表達(dá)基因檢測(cè)比較不同條件下基因表達(dá)量的變化，識(shí)別顯著差異表達(dá)的基因，常用DESeq2、edgeR等R包進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)于準(zhǔn)確識(shí)別差異表達(dá)基因至關(guān)重要，包括生物學(xué)重復(fù)、實(shí)驗(yàn)分組等因素。基因表達(dá)量分析通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)計(jì)算基因的表達(dá)水平，常用RPKM/FPKM等指標(biāo)進(jìn)行量化。基因表達(dá)量分析和差異表達(dá)基因檢測(cè)通過(guò)比對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組，識(shí)別單核苷酸變異（SNP）、插入/刪除等變異類型。變異位點(diǎn)檢測(cè)變異位點(diǎn)功能預(yù)測(cè)和驗(yàn)證方法利用生物信息學(xué)方法和數(shù)據(jù)庫(kù)資源預(yù)測(cè)變異位點(diǎn)的功能影響，如SIFT、PolyPhen等工具。功能預(yù)測(cè)包括PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證、基因型與表型關(guān)聯(lián)分析等，以確認(rèn)變異位點(diǎn)的真實(shí)性和功能影響。驗(yàn)證方法05實(shí)驗(yàn)室安全與法規(guī)遵守要求說(shuō)明FROMBAIDUCHAPTER實(shí)驗(yàn)室安全管理制度及操作規(guī)程實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定詳細(xì)的安全管理制度，包括實(shí)驗(yàn)室人員行為規(guī)范、設(shè)備使用規(guī)定、危險(xiǎn)品存儲(chǔ)與操作要求等。定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行安全檢查，確保各項(xiàng)安全設(shè)施完備且符合規(guī)范要求。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)立安全警示標(biāo)識(shí)，對(duì)潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行提示。制定應(yīng)急處理預(yù)案，對(duì)可能發(fā)生的安全事故進(jìn)行預(yù)防和應(yīng)對(duì)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，選擇適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備，如實(shí)驗(yàn)服、手套、護(hù)目鏡、口罩等。掌握正確的穿戴方法和使用注意事項(xiàng)，避免因操作不當(dāng)而導(dǎo)致的安全事故。定期對(duì)個(gè)人防護(hù)裝備進(jìn)行檢查和更換，確保其處于良好的使用狀態(tài)。對(duì)于特殊操作或高風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)，需采取額外的防護(hù)措施，如使用全面罩或正壓式呼吸器等。個(gè)人防護(hù)裝備選擇與使用指導(dǎo)危險(xiǎn)品管理與廢棄物處理流程實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)危險(xiǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格管理，建立詳細(xì)的臺(tái)賬和使用記錄。危險(xiǎn)品的存儲(chǔ)應(yīng)符合相關(guān)規(guī)范，分類存放、標(biāo)識(shí)清晰，并確保存儲(chǔ)環(huán)境的安全。定期對(duì)危險(xiǎn)品進(jìn)行檢查和盤點(diǎn)，確保其數(shù)量和質(zhì)量與臺(tái)賬相符。廢棄物應(yīng)按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行分類處理，確保不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。相關(guān)法規(guī)政策解讀及合規(guī)性建議實(shí)驗(yàn)室應(yīng)了解和遵守國(guó)家及地方關(guān)于實(shí)驗(yàn)室安全和環(huán)保的法規(guī)政策。01定期對(duì)相關(guān)法規(guī)政策進(jìn)行學(xué)習(xí)和培訓(xùn)，確保實(shí)驗(yàn)室人員的合規(guī)意識(shí)和操作技能。02針對(duì)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，制定符合法規(guī)要求的操作規(guī)程和管理制度。03與相關(guān)部門保持溝通，及時(shí)了解法規(guī)政策的更新和變化，確保實(shí)驗(yàn)室的合規(guī)運(yùn)營(yíng)。0406實(shí)際操作演練與問(wèn)題解答環(huán)節(jié)FROMBAIDUCHAPTER030201DNA樣本制備詳細(xì)演示如何從生物樣本中提取DNA，包括細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)消化和DNA純化等步驟。文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)控展示如何將提取的DNA樣本轉(zhuǎn)化為可用于測(cè)序的文庫(kù)，并進(jìn)行質(zhì)量檢查以確保文庫(kù)質(zhì)量。上機(jī)測(cè)序流程介紹測(cè)序儀的基本操作，包括樣本加載、測(cè)序程序設(shè)置和數(shù)據(jù)收集等。實(shí)驗(yàn)操作演示測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制教授學(xué)員如何使用軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，識(shí)別并去除低質(zhì)量序列。序列比對(duì)與變異檢測(cè)演示如何將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組，并識(shí)別單核苷酸變異、插入/刪除等遺傳變異?；虮磉_(dá)量分析介紹基因表達(dá)量分析的基本原理和方法，包括轉(zhuǎn)錄組組裝、基因表達(dá)定量和差異表達(dá)分析等。數(shù)據(jù)分析軟件使用教程學(xué)員針對(duì)實(shí)驗(yàn)操作演示和數(shù)據(jù)分析軟件使用教程中遇到的問(wèn)題進(jìn)行提問(wèn)。