（生物科技行業(yè)）北大生命科學(xué)院分子生物學(xué)課程教學(xué)講義朱玉賢

分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，是人類(lèi)從分子水平秘，由被動(dòng)地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動(dòng)地改造和重組自然界的基識(shí)到同一生物不同世代之間的連續(xù)性是由生物體自身所的，科學(xué)家為揭示這些遺傳密碼所進(jìn)行的努力就成為人而以生物大分子為研究對(duì)像的分子生物學(xué)就迅速成為現(xiàn)學(xué)。成的到今天，雖然不過(guò)短短一百多年時(shí)間，我們對(duì)生物大分子--細(xì)胞的化學(xué)組成卻有了深刻的認(rèn)識(shí)。孟德?tīng)柕倪z傳學(xué)規(guī)律最先使人們對(duì)性狀證了這些蛋白質(zhì)在輸送分子氧過(guò)程中的特殊作用，成為研究生體構(gòu)型的先驅(qū)。補(bǔ)、能將它所編碼的遺傳信息帶到蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所（細(xì)胞為分子生物學(xué)的發(fā)展做出了重大貢獻(xiàn)。張昌穎等人一道完成了蛋白質(zhì)變性理論、血液生化檢測(cè)和免年代，我國(guó)科學(xué)家相繼實(shí)現(xiàn)了人工全合成有生物學(xué)活性的結(jié)了三方二鋅豬胰島素的晶體結(jié)構(gòu)，采用有機(jī)合成與酶促相結(jié)母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工全合成，在酶學(xué)研究、蛋白質(zhì)與功能等方面都有世所矚目的建樹(shù)。所有生物體中的有機(jī)大分子都是以碳原子為核心，并以共價(jià)鍵的形式與氫、氧、氮及磷以不同方式構(gòu)成的。不僅如此，一切生物3．某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質(zhì)分子決定了分子生物學(xué)研究?jī)?nèi)容:基因表達(dá)調(diào)控-------核酸生物學(xué)生物大分子結(jié)構(gòu)功能----結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)或基因的一部分）按照人們的設(shè)計(jì)定向連接技術(shù)并不完全等于基因工程，因?yàn)楹笳哌€包括其他可能使生酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用則是這一技術(shù)得以建立的關(guān)鍵。技術(shù)還被用來(lái)進(jìn)行基礎(chǔ)研究。如果說(shuō)，分子生物學(xué)研究的核全過(guò)程，也即基因的表達(dá)與調(diào)控。在這里，無(wú)論是對(duì)啟動(dòng)子術(shù)的應(yīng)用。時(shí)序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，序列，所以基因表達(dá)實(shí)質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。原核生物的基因組和染色體結(jié)構(gòu)都比真核生物簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)錄空間內(nèi)發(fā)生，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。真核生轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程在時(shí)間和空間上都被分隔開(kāi)，且在轉(zhuǎn)錄和翻轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因5'端上游特定序列專(zhuān)一結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。究發(fā)現(xiàn)，有許多基因不是將它們的內(nèi)含子全部剪去，子。核酸、蛋白質(zhì)或多糖，在發(fā)揮生物學(xué)功能時(shí)，必須具備兩個(gè)前提:首先，它擁有結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化。結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)就是研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及物學(xué)功能關(guān)系的科學(xué)。它包括結(jié)構(gòu)的測(cè)定、結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)變化），多維核磁研究液相結(jié)構(gòu)，也有人用電鏡三維重組、電子衍頻譜學(xué)方法研究生物高分子的空間結(jié)構(gòu)。義維狀物質(zhì)析出。如稍加攪拌，它就會(huì)象棉線在線軸上的其它成份則呈顆粒狀沉淀。溶解纖維狀物質(zhì)并重復(fù)Theaccuracyoftranslationreliesonthespecificityofbasepairing.Theactualeither(orboth)oftwostages:platebase;forexample,byspecifices.Thiswouldbeapresyntheticerror早在1928年英國(guó)科學(xué)家Griffith等人就發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌使小鼠殘廢的原因是引起肺炎。細(xì)菌的毒性（致病力）是由細(xì)胞表面莢膜中的（transformingprinciple）將無(wú)致病力的細(xì)菌轉(zhuǎn)化成病原細(xì)菌。事噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。噬菌體專(zhuān)門(mén)寄生在細(xì)菌體內(nèi)。它任何一條染色體上都帶有許多基因，一條高等生物的染色物體細(xì)胞內(nèi)的全部遺傳物質(zhì))?？捎^察到的物理或生理現(xiàn)象)。度。單拷貝基因通過(guò)基因擴(kuò)增仍可合成大量的蛋白質(zhì)，如一個(gè)蠶蛋白分子。組成。染色體上的蛋白質(zhì)包括組蛋白和非組蛋白。組蛋白兩者之間。端。屬專(zhuān)一性。(3)幾類(lèi)常見(jiàn)的非組蛋白原核生物中一般只有一條染色體且大都帶有單拷貝基因，幾乎每個(gè)基因序列都與它所編碼的蛋白質(zhì)序列呈線性對(duì)應(yīng)狀態(tài)。ViralDNAmoleculesarerelaEucaryoticcells）＝一.基因與基因表達(dá)的一般概念基因作為唯一能夠自主復(fù)制、永久存在的單位，其生理學(xué)功能strandednucleicacidisduplicatedtogiveidenticalcopies.基因表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個(gè)階段。轉(zhuǎn)錄密碼翻譯成氨基酸序列、合成蛋白質(zhì)多肽鏈的過(guò)程，是基因表達(dá)的最終目的。個(gè)氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)2:→3’的方向連續(xù)閱讀直到終止密碼子，生成基酸注射到大鼠體內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后收獲其肝臟，進(jìn)行蔗糖各種細(xì)胞成份中的放射性蛋白質(zhì)。如果注射后經(jīng)數(shù)小時(shí)（或數(shù)天）收獲肝臟，所有細(xì)胞的蛋白質(zhì);如果注射后幾分鐘內(nèi)即收獲肝臟，那么，放射性標(biāo)記的細(xì)胞質(zhì)成份中。的蛋白質(zhì)序列，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)1:用吖啶類(lèi)試劑（誘導(dǎo)核苷酸插入或丟失）處理T4噬菌體rII位點(diǎn)上的兩個(gè)基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)3:的模板來(lái)決定。氨酸和多聚賴(lài)氨酸。實(shí)驗(yàn)4:實(shí)驗(yàn)5:實(shí)驗(yàn)6:上同源密碼子的配對(duì)問(wèn)題。Crick堿基配對(duì)。三個(gè)密碼子。聯(lián)子密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無(wú)誤地將所（dihydrouracil）命名的。近部位出現(xiàn)的頻率最高，且大多為嘌呤核苷酸。這對(duì)于維持反性及密碼子、反密碼子之間的配對(duì)是很重要的。相配對(duì)，所以?xún)蓚€(gè)不同的功能基團(tuán)最大限度分離。轉(zhuǎn)移到結(jié)構(gòu)極不相同的蛋白質(zhì)分子，信息是以能被翻譯成單密碼形式存在的，在這里起作用的是解碼機(jī)制。成酶識(shí)別。在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核苷酸的改變可能使代表某個(gè)意義的多肽，這種突變就稱(chēng)為無(wú)義突變。第一步是氨基酸活化生成酶-氨基酰腺苷酸復(fù)合物。酶所識(shí)別，困難的是這些酶如何識(shí)別結(jié)構(gòu)上非常相似的氨基酸。有兩道關(guān)口:ThefirstfilteristheinitialbindingoftheaminoacidtotheenzymeanditsactivThesecondfilteristhebindingofincorrectaminoacyl-1.核糖體的組成子。3.核糖體的功能上。糖體。七.信使核糖核酸的。酶參與蛋白質(zhì)合成和加工過(guò)程。③Translocation.2.與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的因子起始因子Initiationfactor（IF）延伸因子Elongationfactor（EF）終止因蛋白質(zhì)合成的起始復(fù)合物:合成的起始可分為三步:基結(jié)合。放三個(gè)起始因子。體，形成翻譯起始復(fù)合物。形成肽鍵。本反應(yīng)可能由peptidyltransferase催化。成肽鍵，這個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物是一條3'羧基端掛了一嘌呤霉素。青霉素、四環(huán)素和紅霉素只與原核細(xì)胞核糖體發(fā)白質(zhì)的合成，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。氯霉素和嘌呤霉素又能與真核生物核糖體結(jié)合，妨礙細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)制了細(xì)胞內(nèi)全部有效成份的生產(chǎn)、運(yùn)轉(zhuǎn)和功能發(fā)揮。貯藏在任何基因中的轉(zhuǎn)移遺傳信息的功能，又能作為核酶直接在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮代謝功能。蛋白質(zhì)是生物信息通路上的終產(chǎn)物，一個(gè)活細(xì)胞在任不同的蛋白質(zhì)。因此，活細(xì)胞內(nèi)時(shí)刻進(jìn)行著各種蛋降解反應(yīng)。使。第五，脫水環(huán)化形成咪唑環(huán)。上。第八-九，由天門(mén)冬酰胺把另一個(gè)氨基加到第2.嘌呤核苷酸合成中的反饋調(diào)節(jié)核苷二磷酸可通過(guò)一個(gè)公用的核苷二磷酸激酶被進(jìn)一步酸。上。催化該反應(yīng)的酶是核糖核苷酸還原酶。大腸桿菌核苷酸還原酶有兩大特征，它的生物學(xué)活酶活性消失。1.還原酶R2亞基處于氧化態(tài)-X˙,向核糖3'位碳原子上的H發(fā)起攻擊，生成3'位自由基。tetrahydrofolate。第一步是在5'-核苷酸酶（5'-nucleotidase）的作用下消去磷酸基團(tuán)，由嘌呤代謝突變會(huì)引起重要疾病。1.銨通過(guò)谷氨酸→谷氨酰胺被結(jié)合到有機(jī)物質(zhì)中。因此，谷氨酰胺合成酶是氮代謝中的主要調(diào)控位點(diǎn)。2.氨基酸的生物合成高等動(dòng)物不能合成大約一半氨基酸，只能從食物（Essential）。表18-1人體必需氨基酸(*.哺乳期至幼兒期必需)3.氨基酸脫羧基化后生成有機(jī)胺。許多重要的神經(jīng)遞質(zhì)都是胺或其次生代謝產(chǎn)4.精氨酸降解產(chǎn)生NO˙(NitricOxide)。凝血和血壓調(diào)控等一系列生理反應(yīng)。雖然它是氣體，極易蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的精確定位。3.特定氨基酸的修飾。4.氨基酸的糖苷化6.有些蛋白質(zhì)還要與輔基(prostheticgroups)相結(jié)合；酶常與Biotin分子相結(jié)合。有些蛋白質(zhì)必須經(jīng)蛋白酶切割后才有功能。有些蛋白質(zhì)只有在形成二硫鍵之后才有功能。有數(shù)個(gè)極性氨基酸，離切割位點(diǎn)最近的那個(gè)分別送到各個(gè)亞細(xì)胞位點(diǎn)。6.蛋白質(zhì)中的核定位序列一般不被切除。蛋白質(zhì)的核定位是通過(guò)多個(gè)蛋白的共同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Importin(α,β亞基)的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)也存在類(lèi)似的蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)系統(tǒng)。來(lái)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)細(xì)胞中存在有錯(cuò)誤或半衰期很短的蛋無(wú)論是只含有一對(duì)染色體的原核細(xì)胞還是帶有多對(duì)染色起始，標(biāo)志了細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)新的周期。個(gè)染色體上一般只有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。位點(diǎn)中都是保守的。主要包括兩個(gè)不同但相互有聯(lián)系的事件，即能主要是由Ter-Tus復(fù)合物（terutilizationsubstance）來(lái)完成的。真核生物的originofreplication被稱(chēng)為ARS-個(gè)replicators分布于酵母的17條染色體中。被修正，充分反映了母鏈的重要性。2.堿基切除修復(fù)（Base-ExcisionRepair）切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。3.核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excisionrepair）酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進(jìn)行修復(fù)。并不十分準(zhǔn)確，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)座過(guò)程中，可移位因子的復(fù)制。a.簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子位。造成該基因突變。IS序列都是可以獨(dú)立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動(dòng)的蛋白。宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個(gè)功能基因兩端時(shí)就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子動(dòng)。轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用有一個(gè)普遍的特征，那就是受體分序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長(zhǎng)度不同，但對(duì)于一個(gè)特轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性?xún)纱箢?lèi)。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。3.轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng)①轉(zhuǎn)座引起插入突變;②轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因;③轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變;④轉(zhuǎn)座引起的生物進(jìn)化.a.依賴(lài)于ρ因子的終止鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來(lái)，從而終止轉(zhuǎn)錄。程。終止過(guò)程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶功能。域。的磷酸二酯鍵發(fā)起進(jìn)攻。傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。達(dá)的操縱子模型。核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。傳密碼。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A.C.Spradling和基因工程中常見(jiàn)的名詞:基因工程的主要內(nèi)容或步驟:出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的物質(zhì)。將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（極移動(dòng)。之前，通過(guò)毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地"吸印"轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)(nucleicacidblotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法交。所以有時(shí)也稱(chēng)這類(lèi)核酸雜交為印跡雜交。子。2'，3'--雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3'-末端，從片段，無(wú)5'→3'外切酶活性。專(zhuān)門(mén)用來(lái)對(duì)核苷酸作化學(xué)修飾，并打斷磷酸二酯鍵(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。特異性切割。交，形成完全互補(bǔ)的雙鏈分子。度。寡核苷酸探針越短，堿基錯(cuò)配造成的去穩(wěn)定效應(yīng)越明顯，較④可用于檢驗(yàn)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的準(zhǔn)確性。過(guò)程叫作基因的定點(diǎn)誘變，是基因工程和蛋白質(zhì)工程的重要手段。a.盒式誘變(cassettemutagenesis)，包括盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變兩種方式。免受消化或降解作用。在電泳凝膠的放射自顯影圖片上，相應(yīng)部位不產(chǎn)生放射性標(biāo)記的條帶。c．甲基化干擾試驗(yàn)(Methylationinterferenceassay)應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase（2）差式雜交(differentialscreen)和扣除雜交(subtractivehybridization)于同一克隆。細(xì)胞學(xué)上，克隆是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitorcell）分裂而隆。文庫(kù)篩選與基因豐度有關(guān)。高豐度基因，如蠶絲A.差式雜交或扣除雜交克隆技術(shù)端，都帶有一段多聚的腺苷酸結(jié)構(gòu)，即通常所說(shuō)的poly(A)尾巴。式。C.cDNA差式分析法(Representat象（Tester）和供試探針（Driver）在接受差式分析前均經(jīng)一個(gè)4起來(lái)的分離基因的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（targetprotein）相互作用的基因。真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上分開(kāi)、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。成一個(gè)功能基因。作用的雜種蛋白的陽(yáng)性菌落。E.基因的圖位克隆法具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過(guò)該方法克隆得到。首先二、利用與目的基因最緊密連鎖的一對(duì)分子標(biāo)記作探針，將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來(lái)。三、理鑒定目的基因。通過(guò)對(duì)許多不同的生態(tài)型及大量限制性?xún)?nèi)切酶和雜交探研究細(xì)胞中任意時(shí)期特異表達(dá)的基因；若把某一生物體內(nèi)全部了解某些基因?qū)μ囟ㄉL(zhǎng)發(fā)育階段的重要性；基因芯片還可斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，原核生物和單細(xì)胞真核生物直接暴露在變幻莫測(cè)的環(huán)境中負(fù)責(zé)糖酵解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)數(shù)量也很大。而象半乳糖一個(gè)體系在需要時(shí)被打開(kāi)，不需要時(shí)被關(guān)閉。這種"開(kāi)-關(guān)"（on-off）活性是通統(tǒng)處于"off"狀態(tài)時(shí)，也有本底水平的基因表達(dá)，常常是每世代每個(gè)細(xì)胞只合成檢測(cè)。動(dòng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，達(dá)調(diào)控的時(shí)間和空間概念，掌握了基因表達(dá)調(diào)控的秘密，我揭示生物學(xué)奧妙的金鑰匙。①轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptionalregulation)；③翻譯水平上的調(diào)控(differentialtranslationofmRNA).原核生物中，營(yíng)養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmentalfactor)對(duì)基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等手段，營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。操縱區(qū)進(jìn)行的。Z編碼β-半乳糖苷酶；Y編碼β-半乳糖苷透過(guò)酶；A編碼β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。β-半乳糖苷酶是一種β-半乳糖苷鍵的專(zhuān)一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透過(guò)酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透過(guò)大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔基轉(zhuǎn)到β-半