高效液相色譜

第六課高效液相色譜1

高效液相色譜是在氣相色譜和經(jīng)典色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質(zhì)的區(qū)別。不同點(diǎn)僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化

操作。經(jīng)典的液相色譜法，流動(dòng)相在常壓下輸送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現(xiàn)代液相色譜法引用了氣相色譜的理論，流動(dòng)相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)

107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn)。所以人們稱它為高壓或高效液相色譜法。2

二、液相色譜分離原理及分類

液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相——固定相和流動(dòng)相組成。液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。3

色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。4三、液相色譜的優(yōu)點(diǎn)（1）應(yīng)用范圍廣

液相色譜則不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70~80%。

5（2）液相色譜類型多，能完成多種不同的分離工作液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜。（3）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，耗材使用費(fèi)用高。6

綜上所述，高效液相色譜法具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。該法已成為現(xiàn)代分析技術(shù)的重要手段之一，目前在化學(xué)、化工、醫(yī)藥、生化、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。7一、固定相高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受

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109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。可承受壓力上限為

108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。81.表面多孔型固定相它的基體是實(shí)心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)到平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受到限制。92.全多孔型固定相由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細(xì)（5~10

m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。10二、流動(dòng)相由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親合力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：（1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。（2）溶劑與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，.應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長比溶劑的紫外截止波長要長。所謂溶劑的紫外截止波長指當(dāng)小于截止波長的輻射通過溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。11（3）高純度由于高效液相色譜靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好（5）低粘度（粘度適中）若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。12（一）液—固色譜法液固色譜的固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，位于其表面的原子、離子或分子的性質(zhì)是多少不同于在內(nèi)部的原子、離子或分子的性質(zhì)的。表層的鍵因缺乏覆蓋層結(jié)構(gòu)而受到擾動(dòng)。因此，表層一般處于較高的能級(jí)，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心

。因此，液固色譜法是根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進(jìn)行分離，故也稱為液固吸附色譜。13吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑的性質(zhì)相似時(shí)，易被吸附，呈現(xiàn)高的保留值；當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時(shí)，易于吸附。從而使吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的官能團(tuán)具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對(duì)同系物沒有選擇性（即對(duì)分子量的選擇性?。?，不能用該法分離分子量不同的化合物。14一、液固色譜法固定相液固色譜法采用的固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見的是活性炭。極性吸附劑可進(jìn)一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧和吡咯衍生物等。各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。在現(xiàn)代液相色譜中，硅膠不僅作為液固吸附色譜固定相，還可作為液液分配色譜的載體和鍵合相色譜填料的基體。15二、液-固吸附色譜流動(dòng)相液相色譜的流動(dòng)相必須符合下列要求：（1）能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)。（2）與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)。（3）粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。（4）應(yīng)與所用檢測(cè)器相匹配。例如利用紫外檢測(cè)器時(shí)，溶劑要不吸收紫外光。16在液-固色譜中，選擇流動(dòng)相的基本原則是極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來使用，如果樣品組分的分配比k值范圍很廣則使用梯度洗脫。17（二）液液色譜法液液色譜又稱液液分配色譜。在液液色譜中，一個(gè)液相作為流動(dòng)相，而另一個(gè)液相則涂漬在很細(xì)惰性載體或硅膠上作為固定相。流動(dòng)相與固定相應(yīng)互不相溶，兩者之間應(yīng)有一明顯的分界面。分配色譜過程與兩種互不相溶的液體在一個(gè)分液漏斗中進(jìn)行的溶劑萃取相類似。以氣液分配色譜法一樣，這種分配平衡的總結(jié)果導(dǎo)致各組分的差速遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離。分配系數(shù)（K）或分配比（k）小的組分，保留值小，先流出柱。然而與氣相色譜法不同的是，流動(dòng)相的種類對(duì)分配系數(shù)有較大的影響。18一、固定相液液色譜的固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：（1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體），由直徑為30~40m的實(shí)心玻璃球和厚度約為1~2m的多孔性外層所組成。（2）全多孔型載體，由硅膠、硅藻土等材料制成（3）全多孔型微粒載體，由nm級(jí)的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。19二、流動(dòng)相在液液色譜中，除一般要求外，還要求流動(dòng)相對(duì)固定相的溶解度盡可能小，因此固定液和流動(dòng)相的性質(zhì)往往處于兩個(gè)極端，例如當(dāng)選擇固定液是極性物質(zhì)時(shí)，所選用的流動(dòng)相通常是極性很小的溶劑或非極性溶劑。以極性物質(zhì)作為固定相，非極性溶劑作流動(dòng)相的液液色譜，稱為正相分配色譜，適合于分離極性化合物；反之，如選用非極性物質(zhì)為固定相，而極性溶劑為流動(dòng)相的液液色譜稱為反相分配色譜，這種色譜方法適合于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物。20（三）離子交換色譜法離子交換色譜以離子交換樹脂為固定相，樹脂上具有固定離子基團(tuán)及可交換的離子基團(tuán)。當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過固定相時(shí)，組分離子與樹脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交換，根據(jù)組分離子對(duì)樹脂親合力不同而得到分離。一、固定相離子交換色譜常用的固定相為離子交換樹脂。目前常用的離子交換樹脂分為三種形式：一是常見的純離子交換樹脂；第二種是玻璃珠等硬芯子表面涂一層樹脂薄層構(gòu)成的表面層離子交換樹脂；第三種為大孔徑網(wǎng)絡(luò)型樹脂。21

典型的離子交換樹脂是由苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)共聚而成。其中，二乙烯苯起到交聯(lián)和加牢整個(gè)結(jié)構(gòu)的作用，其含量決定了樹脂交聯(lián)度的大小。交聯(lián)度一般控制在4~16%范圍內(nèi)，高度交聯(lián)的樹脂較硬而且脆，但選擇性較好。在基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上引入各種不同酸堿基團(tuán)作為可交換的離子基團(tuán)。

按結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂上具有與陽離子交換的基團(tuán)。陽離子交換樹脂又可分為強(qiáng)酸性和弱酸性樹脂。強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂所帶的基團(tuán)為-SO3-H+

，其中-SO3-和有機(jī)聚合物牢固結(jié)合形成固定部分，H+是可流動(dòng)的能為其它陽離子所交換的離子。

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陰離子交換樹脂具有與樣品中陰離子交換的基團(tuán)。陰離子交換樹脂也可分為強(qiáng)堿性和弱堿性樹脂。二、流動(dòng)相離子交換樹脂的流動(dòng)相最常使用水緩沖溶液，有時(shí)也使用有機(jī)溶劑如甲醇或乙醇同水緩沖溶液混合使用，以提高特殊的選擇性，并改善樣品的溶解度。23（四）化學(xué)鍵合相色譜將固定液機(jī)械地涂漬在載體上組成固定相。盡管選用與固定液不互溶的溶劑作流動(dòng)相，但在色譜過程中固定液仍會(huì)有微量溶解。以及流動(dòng)相經(jīng)過色譜柱的機(jī)械沖擊，固定相會(huì)不斷流失。

70年代初發(fā)展了一種新型的固定相—化學(xué)鍵合固定相。這種固定相是通過化學(xué)反應(yīng)把各種不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，代替機(jī)械涂漬的液體固定相。這不僅避免了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分離的選擇性，化學(xué)鍵合色譜適用于分離幾乎所有類型的化合物。24根據(jù)鍵合相與流動(dòng)相之間相對(duì)極性的強(qiáng)弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動(dòng)相的極性比固定相極性要小，所以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛。25一、化學(xué)鍵合固定相法化學(xué)鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應(yīng)之前，要對(duì)硅膠進(jìn)行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機(jī)物或有機(jī)硅化合物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。鍵合相可分為四種鍵型：（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相將醇與硅膠表面的羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應(yīng)生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。（2）硅氮型（=Si-N=）鍵合相如果用SOCl2將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與各種有機(jī)胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合相?？捎梅菢O性或強(qiáng)極性的溶劑作為流動(dòng)相。26（3）硅碳型（=Si-C=）鍵合相將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉(zhuǎn)化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機(jī)基團(tuán)直接鍵合在硅膠表面上。（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相將硅膠與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。這類鍵合相具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最為廣泛的鍵合相。27二、反相鍵合相色譜法

在反相色譜中，一般采用非極性鍵合固定相，如硅膠-C18H37（簡稱ODS或C18）硅膠-苯基等，用強(qiáng)極性的溶劑為流動(dòng)相，如甲醇/水，乙腈/水，水和無機(jī)鹽的緩沖液等。目前，對(duì)于反相色譜的保留機(jī)制還沒有一致的看法，大致有兩種觀點(diǎn)：一種認(rèn)為屬于分配色譜，另一種認(rèn)為屬于吸附色譜。分配色譜的作用機(jī)制是假設(shè)混合溶劑（水+有機(jī)溶劑）中極性弱的有機(jī)溶劑吸附于非極性烷基配合基表面，組分分子在流動(dòng)相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進(jìn)行分配。28吸附色譜的作用機(jī)制是把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用水與有機(jī)溶劑所組成的極性溶劑為流動(dòng)相來分離有機(jī)化合物時(shí)，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會(huì)從水中被“擠”出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，使它離開固定相，減少保留值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。29一般地，固定相的烷基配合基或分離分子中非極性部分的表面積越大，或者流動(dòng)相表面張力及介電常數(shù)越大，則締合作用越強(qiáng)，分配比也越大，保留值越大。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。30三、正相鍵合色譜法

在正相色譜中，一般采用極性鍵合固定相，硅膠表面鍵合的是極性的有機(jī)基團(tuán)，鍵合相的名稱由鍵合上去的基團(tuán)而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）鍵合相。流動(dòng)相一般用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機(jī)溶劑，如烴類溶劑，或其中加入一定量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等），以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度。通常用于分離極性化合物。31

一般認(rèn)為正相色譜的分離機(jī)制屬于分配色譜。組分的分配比K值，隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相中極性調(diào)節(jié)劑的極性增大（或濃度增大）而降低。同時(shí)，極性鍵合相的極性越大，組分的保留值越大。該法主要用于分離異構(gòu)體，極性不同的化合物，特別是用來分離不同類型的化合物。32四、離子性鍵合相色譜法當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)化學(xué)各種離子交換基團(tuán)如-SO3H,-CH2NH2,-COOH,-CH2N(CH3)Cl等時(shí)，形成了所謂的離子性鍵合色譜。其分離原理與離子交換色譜一樣，只是填料是一種新型的離子交換劑而已?；瘜W(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點(diǎn)：（1）適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以33通過改變流動(dòng)相的組成合乎種類來有效地分離非極性、極性和離子型化合物。（2）由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。（3）鍵合固定相對(duì)不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。（4）固定相柱效高，使用壽命長，分析重現(xiàn)性好。34（五）排阻色譜法排阻色譜法也稱空間排阻色譜或凝膠滲透色譜法，是一種根據(jù)試樣分子的尺寸進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。排阻色譜的色譜柱的填料是凝膠，它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網(wǎng)狀物質(zhì)。凝膠的孔穴僅允許直徑小于孔開度的組分分子進(jìn)入，這些孔對(duì)于流動(dòng)相分子來說是相當(dāng)大的，以致流動(dòng)相分子可以自由地?cái)U(kuò)散出入。對(duì)不同大小的組分分子，可分別滲入到凝膠孔內(nèi)的不同深度，大個(gè)的組分分子可以滲入到凝膠的大孔內(nèi)，但進(jìn)不了小孔甚至于完全被排斥。小個(gè)的組分分子，大孔小孔都可以滲入，甚至進(jìn)入很深，一時(shí)不易洗脫出來。35因此，大的組分分子在色譜柱中停留時(shí)間較短，很快被洗脫出來，它的洗脫體積很小，小的組分分子在色譜柱中停留時(shí)間較長，洗脫體積較大，直到所有孔內(nèi)的最小分子到達(dá)柱出口，完成按分子大小而分離的洗脫過程。

尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。

36排阻色譜的固定相一般可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。所謂凝膠，指含有大量液體（一般是水）的柔軟而富有彈性的物質(zhì)，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體。37（1）軟性凝膠如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶漲到它干體的許多倍。它們適用于水溶性作流動(dòng)相，一般用于小分子質(zhì)量物質(zhì)的分析，不適宜在高效液相色譜中。（2）半剛性凝膠如高交聯(lián)度的聚苯乙烯。常以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。（3）剛性凝膠如多孔硅膠、多孔玻璃等，它們既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作。38（六）色譜分離方法的選擇

要正確地選擇色譜分離方法，首先必須盡可能多的了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜分離方法的主要根據(jù)是樣品的相對(duì)分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。39第九節(jié)色譜分離方法的選擇一、相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。相對(duì)分子質(zhì)量在200~2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對(duì)分子質(zhì)量高于2000，則可用空間排阻色譜法。二、溶解度水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法；油溶性樣品或相對(duì)非極性的混合物，可用液-固色譜法。40三、化學(xué)結(jié)構(gòu)若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（例如配位體及有機(jī)螯合劑），可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的分離可用液固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對(duì)于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。41第二節(jié)高效液相色譜儀高效液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)等五大部分組成。分析前，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相，開泵，沖洗柱子，待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進(jìn)樣口，流動(dòng)相把試樣帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的組分依次流入檢測(cè)器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當(dāng)有樣品組分流過流通池時(shí)，檢測(cè)器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，經(jīng)過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色譜圖是定性、定量和評(píng)價(jià)柱效高低的依據(jù)。42

一、高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)由溶劑貯存器、高壓泵、梯度洗脫裝置和壓力表等組成。

1.溶劑貯存器溶劑貯存器一般由玻璃、不銹鋼或氟塑料制成，容量為1到2L，用來貯存足夠數(shù)量、符合要求的流動(dòng)相。

2.高壓輸液泵高壓輸液泵是高效液相色譜儀中關(guān)鍵部件之一，其功能是將溶劑貯存器中的流動(dòng)相以高壓形式連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。43對(duì)泵的要求：輸出壓力高、流量范圍大、流量恒定、無脈動(dòng)，流量精度和重復(fù)性為0.5%左右。此外，還應(yīng)耐腐蝕，密封性好。高壓輸液泵，按其性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵兩大類。恒流泵是能給出恒定流量的泵，其流量與流動(dòng)相粘度和柱滲透無關(guān)。恒壓泵是保持輸出壓力恒定，而流量隨外界阻力變化而變化，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。443.梯度洗脫裝置

梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。梯度洗脫裝置分為兩類：一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動(dòng)相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺(tái)泵即可。另一類是內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯度），將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設(shè)置的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系統(tǒng)。45

梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫，所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來達(dá)到。46二、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。三、分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2~6mm，柱長為10~50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫。47四、檢測(cè)器檢測(cè)器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對(duì)檢測(cè)器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。在液相色譜中，有兩種類型的檢測(cè)器，一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。屬于此類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等；另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)。屬于此類檢測(cè)器有示差折光檢測(cè)器等。48第四節(jié)討論1．對(duì)蛋白質(zhì)活性的考慮所要研究的樣品，還要通過活性的檢測(cè)或其他特性的鑒定，才能從諸多的蛋白質(zhì)中鑒別分離得到。盡管這一點(diǎn)是顯而易見的，但是也常常被從事蛋白質(zhì)研究不久的生化工作者忽視。為此，不論用何種分法，其中包括色譜技術(shù)，分離純化蛋白質(zhì)樣品前，原則上說，首先建立所要研究的蛋白質(zhì)的活性檢測(cè)方法。活性檢測(cè)方法不僅可以從分離所得到的諸多的蛋白質(zhì)組分中，鑒別到所要研究的樣品，而且還能對(duì)所用的分離純化方法的優(yōu)劣作出評(píng)估。49

如果在分離純化后，研究對(duì)象的比活(即單位重量的蛋白質(zhì)所表現(xiàn)的活性)沒有提高，則說明研究的對(duì)象和其他的雜質(zhì)蛋白在所用的這種分離過程中沒有能分開。如果在分離純化后，盡管所需的樣品比活有所提高，但是總的活性回收率卻很低，這提示在整個(gè)分離純化過程中，所研究的樣品或是有損失，或是有失活現(xiàn)象?？傊?，比活提高不明顯，或是總活性回收率不高，都說明了所用的分離純化方法不理想，應(yīng)該更換其他的分離方法。

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旨在測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可以不考慮所得樣品的生物活性，只要能得到某些特定結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的蛋白質(zhì)，即能用于結(jié)構(gòu)測(cè)定。例如可以用專一的抗血清檢測(cè)，收集具有免疫反應(yīng)的級(jí)分，或是用通過SDS測(cè)定所得蛋白質(zhì)組分的分子質(zhì)量，收集所需分子質(zhì)量的部分。51

2．評(píng)價(jià)與文獻(xiàn)結(jié)果的差異經(jīng)常有人在重復(fù)文獻(xiàn)時(shí)，得不到相同的結(jié)果，甚至差別很大?？赡苡邢率鲆蛩匾紤]。①柱效如何。如果柱效很低，再花很多精力在其他條件探討上也是白搭。②柱的型號(hào)、孔徑、顆粒度等是否與文獻(xiàn)一樣。如反相柱，有C-18，08，04，C-2等亞型。分離氨基酸。肽等則常用C-18的柱；分離蛋白質(zhì)則常用C-4，08的柱。另外，生產(chǎn)廠商也很有關(guān)系。③采用不同公司的HPLC儀器，由于產(chǎn)生梯度的方式不完全一樣，管道的長短和死體積不一樣，因此設(shè)定的梯度和實(shí)際的梯度會(huì)不同。即看來兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室表面上的條件相同，事實(shí)上可能不同。這要求參考文獻(xiàn)的試驗(yàn)條件，在具體條件上作一些調(diào)整，才能得到滿意的結(jié)果。盲目相信文獻(xiàn)，不如沒有文獻(xiàn)。52每年進(jìn)入夏季，