實驗四血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳

【實驗?zāi)康摹空莆针娪痉ǚ蛛x血清蛋白質(zhì)的原理掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義12/8/20241當前1頁，共38頁，星期日。電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術(shù)【實驗原理】12/8/20242當前2頁，共38頁，星期日。H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH<pI12/8/20243當前3頁，共38頁，星期日。電泳速度:帶電粒子在電場中運動時，單位電場強度內(nèi)粒子運動的速度，以u表示，即

V—粒子運動的速度X—電場強度Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑η—介質(zhì)的粘度12/8/20244當前4頁，共38頁，星期日。影響電泳速度的因素1.樣品本身：分子形狀：形狀越小，與支持物介質(zhì)摩擦越小，u越大。球形分子>纖維狀分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；12/8/20245當前5頁，共38頁，星期日。2.緩沖溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大離子強度(I)：I越大，電動電勢越小，u越小；I越小，電動電勢越大，u越大，但樣品易擴散。離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.02～0.2之間。12/8/20246當前6頁，共38頁，星期日。電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。3.電場強度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，u越快。電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。在進行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變性而無法分離12/8/20247當前7頁，共38頁，星期日。4.支持介質(zhì)：①纖維薄膜(玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜)②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)12/8/20248當前8頁，共38頁，星期日。負極正極－－－－－－－－表面帶負電荷帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動

如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。電滲作用：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。＋＋＋＋＋＋＋＋以紙電泳為例:12/8/20249當前9頁，共38頁，星期日。區(qū)帶電泳的分類（一）支持物物理性狀1．濾紙及其它纖維(如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖維薄膜)電泳2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；3．凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；4．絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。12/8/202410當前10頁，共38頁，星期日。（二）支持物裝置形式：1．平板式電泳：支持物水平放置；2．垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳12/8/202411當前11頁，共38頁，星期日。(三)pH連續(xù)性：1．連續(xù)pH電泳：即整個電泳過程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。2．非連續(xù)pH電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電脈，等電聚焦電泳等12/8/202412當前12頁，共38頁，星期日。醋酸纖維薄膜為支持物pH=8.6的巴比妥緩沖液血清蛋白的pI均小于8.6負電荷電泳時向正極移動由于遷移率不同而被分離12/8/202413當前13頁，共38頁，星期日。當前25頁，共38頁，星期日。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強度為0.當前9頁，共38頁，星期日。繪出電泳圖譜并標明各條帶含義②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中。取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：當前31頁，共38頁，星期日。當前32頁，共38頁，星期日。1．連續(xù)pH電泳：即整個電泳過程pH保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳等。蓋電泳槽蓋，平衡10min點樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點樣面朝下)當前23頁，共38頁，星期日。選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.γβα2α1清蛋白分子越小，泳動速度越快帶電量越多，泳動速度越快12/8/202414當前14頁，共38頁，星期日。膜條經(jīng)過氨基黑10B染色后顯出清晰色帶。2.定性,定量各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中。用分光光度法計算各種蛋白質(zhì)的百分數(shù)。12/8/202415當前15頁，共38頁，星期日。醋酸纖維薄膜：醋酸纖維加工的細密且薄的微孔膜廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)臨床各種生物分子的分離分析血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、類固醇及同工酶等12/8/202416當前16頁，共38頁，星期日。優(yōu)點：簡單快速缺點分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGE）不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）12/8/202417當前17頁，共38頁，星期日?！酒鞑募霸噭?、器材：醋酸纖維薄膜（2×8cm）常壓電泳儀竹鑷點樣器人血清或雞血清粗濾紙2、試劑：巴比妥緩沖液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液12/8/202418當前18頁，共38頁，星期日。5mA/片，電泳60~90min繪出電泳圖譜并標明各條帶含義當前18頁，共38頁，星期日。Q—粒子所帶電荷r—粒子的半徑調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期早期：選擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。甲胎蛋白、類固醇及同工酶等實驗的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)當前23頁，共38頁，星期日。蓋電泳槽蓋，平衡10min取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min帶電量越多，泳動速度越快[操作]（一）儀器與薄膜的準備1、醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇2.電泳槽的準備3、電極槽的平衡12/8/202419當前19頁，共38頁，星期日。（二）點樣取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上點樣區(qū)距陰極端1.5cm血清均勻涂在點樣器表面將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)形成一定寬度、粗細均勻的直線

實驗的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)12/8/202420當前20頁，共38頁，星期日。（三）電泳點樣端薄膜平貼陰極電泳槽支架濾紙橋(點樣面朝下)

另一端平貼在陽極端支架

要求：薄膜緊貼濾紙橋并繃直，薄膜之間相隔幾毫米蓋電泳槽蓋，平衡10min打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強度為0.3mA/片，通電10min調(diào)節(jié)電流強度為0.5mA/片，電泳60~90min

電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O，關(guān)閉電泳儀切斷電源12/8/202421當前21頁，共38頁，星期日。DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-Ⅲ型電泳槽12/8/202422當前22頁，共38頁，星期日。12/8/202423當前23頁，共38頁，星期日。離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定不適于制備（薄膜厚度約10～100μm，樣品用量很少）取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5minγβα2α1血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白當前3頁，共38頁，星期日。分子越小，泳動速度越快取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上3．垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡2．粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；②凝膠(瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠)繪出電泳圖譜并標明各條帶含義選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.3mA/片，通電10min12/8/202424當前24頁，共38頁，星期日。【實驗注意事項】不要用手觸摸纖維素膜注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面點樣位置要在1.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近不要重復(fù)點樣膜放進電泳槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極12/8/202425當前25頁，共38頁，星期日。用點樣器點樣時不要點的太多，但也不能太少線條均勻，用力水平。電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液12/8/202426當前26頁，共38頁，星期日。（四）染色和漂洗取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min自來水沖洗，漂洗液漂洗更換3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜12/8/202427當前27頁，共38頁，星期日?！緦嶒灲Y(jié)果】繪出電泳圖譜并標明各條帶含義12/8/202428當前28頁，共38頁，星期日。12/8/202429當前29頁，共38頁，星期日。臨床意義血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量60～80g/L絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細胞合成

正常值： 白蛋白57％~72％，α1球蛋白2％~5％α2球蛋白4％~9％，β球蛋白6.5％~12％γ球蛋白12％—20％12/8/202430當前30頁，共38頁，星期日?？赡芟嚓P(guān)疾病清蛋白α1球蛋白α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白骨髓瘤↑*腎病綜合癥↓↑*↑*腎炎↑*↑肝硬化↓↑*急性肝壞死↓*↑↑↑↑傳染性肝炎↓↑*↑*急性感染初期↑*↑*↑*慢性炎癥/感染后期↑*低

球蛋白血癥↓*臨床上還可用A/G比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：正常人A/G＝1.5～2.512/8/202431當前31頁，共38頁，星期日。血漿蛋白的主要功能維持血漿膠體滲透壓調(diào)節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡運輸營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用12/8/202432當前32頁，共38頁，星期日。白蛋白降低：

合成能力不足：肝功能下降

合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期

去路增加：腎病綜合癥，嚴重燒傷，大出血等

消耗過多：糖尿病，甲亢等12/8/202433當前33頁，共38頁，星期日。球蛋白增加：感染，多發(fā)性骨髓瘤，自身免疫性疾病等球蛋白降低：皮質(zhì)功能亢進，免疫缺陷病12/8/202434當前34頁，共38頁，星期日。肝?。篈,α2-G,β-G,α1-G,γ-G，A/G下降甚至倒置腎?。涸缙冢哼x擇性蛋白尿，Mw較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。如白蛋白后期：非選擇性蛋白尿，Mw較小的蛋白質(zhì)丟失，含量下降分子量較大的蛋白質(zhì)（如γ-球蛋白）丟失，含量下降12/8/202435當前35頁，共38頁，星期日?！緦嶒炈伎肌?．電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極？為什么？2．電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種成分？請分析原因12/8/202436當前36頁，共38頁，星期日?！境Ｒ妴栴}及原因】1.電泳圖譜不齊