真核細(xì)胞rna提取的實(shí)驗(yàn)報(bào)告范文

Word1/1真核細(xì)胞rna提取的實(shí)驗(yàn)報(bào)告范文篇二：真核細(xì)胞RNA的提取

RNA是基因表達(dá)產(chǎn)物，由以下幾類分子組成，rRNA（占細(xì)胞總RNA的80%～85%）、tRNA和核內(nèi)小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物學(xué)的主要討論對象，分別制備mRNA是克隆基因，分析基因表達(dá)以及建立cDNA文庫的首要步驟。

真核細(xì)胞總RNA分別提取的目的是要獲得高純度的具有充分長度的RNA分子，包括RNA的純度和完整性。RNA分別的關(guān)鍵是盡量削減RNA酶的污染。RNA酶活性特別穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性的RNA酶外，環(huán)境中也存在RNA酶。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量制造一個(gè)無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性。主要是采納RNA酶的阻抑蛋白RNasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑鹽酸胍或異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶，采納焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

一、RNA提取的關(guān)鍵

真核細(xì)胞RNA的提取過程有四個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，即①樣品（細(xì)胞或組織）的有效破裂；②有效地使核蛋白復(fù)合體變性；③對內(nèi)源RNA酶的有效抑制；④有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分別；其中最關(guān)鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸雜交、cDNA合成以及體外翻譯等。

二、組織RNA提取的基本步驟

1.儀器：勻漿器、低溫離心機(jī)、離心管。

2.試劑：氯仿、75%乙醇、異丙醇、DEPC溶液、1%甲醛變性膠、37%甲醛、3%過氧

化氫、甲酰胺、RNA上樣緩沖液。

3.主要步驟

（1）取組織50~100mg，加0.8mlTrizol沖洗勻漿器，移入同一離心管，冰上靜置5min。

氯仿，充分震蕩混勻，靜置

0.5ml異丙醇，顛倒混勻。－

1ml75%乙醇溶液，漂洗沉

淀，

10min。

lDEPC溶液，充分溶解RNA

RNA溶解液，按肯定比例稀釋后，紫外分光光度計(jì)測

值，計(jì)算OD260/OD280

OD260＝1時(shí)，RNA濃度約為

）＝OD260×稀釋倍數(shù)×40

1%甲醛變性膠電泳觀看

甲醛變性凝膠板：4.5μlRNA，120xxg×℃靜置2h，4℃1.7~2.0，依據(jù)下述公式計(jì)算×甲醛膠電泳緩沖液，離心。棄沉淀?！?0min×5min離心。：1之間，說明RNA濃度：3%過氧化3.5μl37%甲（2）加0.2ml3min，4℃15min（3）取上清，加入204℃，120xxg離心。（4）棄上清，取沉淀，加入，7500g（5）棄上清，沉淀真空干燥（6）加40μ。4.結(jié)果鑒定（1）紫外分光光度計(jì)檢測：取定260nm、280nmOD比值，假如比值在RNA純度可。標(biāo)準(zhǔn)樣品當(dāng)40μg/mlRNA濃度（μg/ml。（2）電泳檢測：RNA質(zhì)量，電泳槽及制膠板先用氫浸泡過夜；制1%，2ul5

醛，10ul甲酰胺，離心混勻，65℃變性15min后，快速置冰浴中；再加入2μlRNA上樣緩沖液，離心混勻后上樣，6V/cm電壓，電泳1～2h；暗室內(nèi)紫外光下觀看，拍照；假如觀看到清楚的18S、28SRNA電泳帶，無大量小分子RNA，說明RNA無明顯降解，樣品－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、留意事項(xiàng)

1、全部玻璃器皿160～180℃高溫干烤6h以上，非耐高溫器皿經(jīng)0.1%DEPC液浸泡后，經(jīng)高溫（15磅，20min）處理滅活RNA酶，所用試劑均用DEPC水配制，然后高壓處理。

2、試驗(yàn)用水要經(jīng)DEPC處理，但含Tris的試劑不能用DEPC處理。

3、試驗(yàn)操作過程中要戴一次性手套，以避開RNA酶污染。

藥大0942605

篇三：真核細(xì)胞rna提取

試驗(yàn)原理：

依據(jù)成熟雌蟾蜍體內(nèi)含大量卵細(xì)胞且可以便利獵取，細(xì)胞內(nèi)含核酸豐富，沒有其它組織器官等的干擾等優(yōu)點(diǎn)以確定蟾蜍卵細(xì)胞為試驗(yàn)所需的真核細(xì)胞。通過TRIZOL溶液中變性劑破裂真核細(xì)胞，然后經(jīng)過氯仿等有機(jī)溶劑抽提RNA，再利用RNA不溶于異丙醇的性質(zhì)將自身析出，達(dá)到分別提純的目的。

TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增加抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消逝，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白快速與核酸分別。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。

甲基綠—吡羅紅為堿性染料，它分別能與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。當(dāng)甲基綠與吡羅紅作為混合染料時(shí)，甲基綠與染色質(zhì)中DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色；吡羅紅與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色。其緣由可能是兩種染料的混合染液中有競爭作用，同時(shí)兩種核酸分子都是多聚體，而其聚合程度有所不同。甲基綠易與聚合程度高的DNA結(jié)合呈現(xiàn)綠色。而吡羅紅則與聚合程度較低的RNA結(jié)合呈現(xiàn)紅色（但解聚的DNA也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅色）。即RNA對派洛寧親和力大，被染成紅色，而DNA對甲基綠親和力大，被染成綠色。09419

試驗(yàn)材料：

（一）試劑

1.甲基綠—吡羅紅染料：①染色劑A液的兩種配制方法

第一種方法：取吡羅紅甲基綠粉1g，加入到100mL蒸餾水中溶解，然后用濾紙過濾，將濾液放入棕色瓶中備用。

其次種方法：取甲基綠2g溶于98mL蒸餾水中，取吡羅紅G5g溶于95mL蒸餾水中。取6mL甲基綠溶液和2mL吡羅紅溶液加入到16mL蒸餾水中，即為A液，放入棕色瓶中備用。（留意：用于核酸染色的是吡羅紅G，請不要錯(cuò)買吡羅紅B。）

②染色劑B液的配制方法B液是一種緩沖液，由乙酸鈉和乙酸混合而成。先取乙酸鈉16.4g，用蒸餾水溶解至1000mL備用；再取乙酸12mL，用蒸餾水稀釋至1000mL備用。取配好的乙酸鈉溶液30mL和稀釋的乙酸20mL，加蒸餾水50mL，配成pH為4.8的B液（緩沖液）。

③染色劑的配制染色劑是由A液、B液混合配制而成的。取A液20mL和B液80mL混合，就是試驗(yàn)中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。應(yīng)當(dāng)留意的是該試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.TRIZOL試劑（Invitrogen公司購買）

3.75%乙醇

4.氯仿

5.異丙醇

6.Nacl(0.14m/l)

（二）器材

1.離心機(jī)（3000r.p.m）

2.冰浴

3．研缽

4.燒杯

5.量筒

6.試管

7.玻棒

8.膠頭滴管9

9.離心管

10.天平

試驗(yàn)方法：

制備勻漿：

以班級為單位，稱取也許10g蟾蜍卵細(xì)胞（2~3℃保存），于研缽（可置于冰浴鍋上）中，依據(jù)10~30mg組織細(xì)胞加1mltrizol試劑的量加入其中，快速研磨，制備勻漿。試驗(yàn)二人合作為一組，每組取也許10ml勻漿。

RNA的提取：

取回勻漿后，室溫靜置10min，使樣品充分裂解——離心(3000r.p.s)20mins——取上清液移至新的離心管——加1/5TRIZOL溶液體積氯仿——在手中反復(fù)振蕩搖勻，室溫靜置10min?！x心20mins——取上清液——在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10min?！浞只靹?，靜置10minute——離心20min——沉淀用75%乙醇洗滌兩次

定性試驗(yàn)：

取2支潔凈試管，一管加入1.5MLRNA溶液（將RNA顆粒狀的沉淀溶于

2ML0.14/NACL溶液中），另一管加入蒸餾水1.5ML,像兩管中加入3M甲基綠-吡羅紅染色劑，溶液變成紅色為陽性反應(yīng)。

試驗(yàn)結(jié)果：