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文檔簡介

實驗八-酪氨酸酶動力學(xué)實驗九酪氨酸酶的動力學(xué)1.學(xué)會測定酶反應(yīng)速度的基本方法。2.掌握測定米氏常數(shù)Km值的原理和方法。

【目的和要求】【實驗原理】酪氨酸酶催化的反應(yīng)為：

475nm常用單位時間內(nèi)、產(chǎn)物的濃度增加量表示。一、酶活力測定—酶反應(yīng)初速度的測定:TimeProductConcentrationv=dC/dtA=εCd:3600M-1cm-1d:1cm確定酶反應(yīng)時間！二、底物濃度[S]對酶反應(yīng)速度：一級反應(yīng)混合級反應(yīng)零級反應(yīng)Effectofsubstrateconcentrationontheinitialvelocityofanenzyme-catalyzedreaction.?VmaxKm

Km值測定:雙倒數(shù)作圖法（一）酶反應(yīng)初速度的測定：---酶反應(yīng)時間的確定在比色杯中，按下表依次加入試劑：【實驗方法】加入酶液后立即混勻，并每隔15秒讀取475nm處的吸光值。L-多巴（mL）1磷酸緩沖液（mL）1.97酪氨酸酶（mL）0.03注：酪氨酸酶5U/

l繪制產(chǎn)物濃度C-Time反應(yīng)曲線，觀察酶反應(yīng)初速度，確定酶反應(yīng)時間。一般在30~120秒左右。

時刻（秒）A時刻（秒）A0135151503016545180601957521090225105240120255各時刻的吸光值記錄在下表：（二）米式常數(shù)的測定：在比色杯中，采用已確定的酶反應(yīng)時間X，分別記錄各管反應(yīng)開始時A0和X秒鐘后的A1。管號15mML－多巴(ml)磷酸緩沖液（ml）

酪氨酸酶（ml）

10.22.770.0320.32.670.0330.42.570.0340.52.470.0350.62.370.03每管反應(yīng)體系仍為3ml。記錄數(shù)據(jù)于下表：利用雙倒數(shù)作圖法，橫坐標(biāo)為1/S，縱坐標(biāo)為1/v，分別求出Vmax和Km。

管號L－多巴濃度（mM）A0A1ΔA（A1-A0）V（mM/min）12345

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