高二 人教版-生物學(xué)選擇性必修3 第3章《基因工程的基本操作程序（第3課時(shí)）》課件

高二—人教版—生物學(xué)選擇性必修3—第3章基因工程的基本操作程序（第3課時(shí)）PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一種高效的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中具有非常廣泛的用途，不僅應(yīng)用在基因工程的基本操作程序中，還應(yīng)用在遺傳病的診斷、刑偵破案、新型冠狀病毒核酸檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。

探究?實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定目的要求：1、了解PCR和電泳鑒定的基本原理。2、嘗試進(jìn)行PCR的基本操作，以及用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物鑒定。一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR（一）實(shí)驗(yàn)原理2.PCR還利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。1.

PCR擴(kuò)增DNA片段的原理：DNA半保留復(fù)制。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)?；仡櫍篜CR反應(yīng)過(guò)程變性（超過(guò)90℃，解旋）↓復(fù)性（50℃左右，引物與模板結(jié)合）↓延伸（72℃左右，合成新的DNA鏈）（二）材料用具1.PCR儀：自動(dòng)控溫的儀器，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR2.微量離心管：進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所。總?cè)萘繛?.2mL（左）和0.5mL(右）的微量離心管PCR儀器（二）材料用具3.微量移液器：用于量取轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體。一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR4.一次性吸液槍頭：微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭。不同型號(hào)的微量移液器吸取溶液的體積（量程）不同。如：0.5-10μL，20—200μL，100—1000μL，1000—5000μL等。一次性槍頭設(shè)定吸取體積時(shí)，嚴(yán)禁將體積刻度調(diào)到超出微量移液器量程范圍，用完后調(diào)到最大刻度。（二）材料用具一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR5.微量移液器的使用容量設(shè)定吸液槍頭安裝吸液放液卸去吸液槍頭利用調(diào)節(jié)旋鈕設(shè)定。旋轉(zhuǎn)安裝法，用力不能過(guò)猛。按壓推動(dòng)桿至第一停點(diǎn)，然后將吸液槍頭垂直進(jìn)入液面，再平穩(wěn)松開(kāi)。槍頭緊貼容器壁，按壓推動(dòng)桿至第一停點(diǎn)，稍作停頓后再按壓至第二停點(diǎn)，以確保吸液槍頭內(nèi)沒(méi)有液體殘留。按壓卸載槍頭按鈕。一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR視頻微量移液器的使用（二）材料用具5.微量移液器的使用（二）材料用具一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR6.

PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體系的配方模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制PCR反應(yīng)體系：1.DNA模板；2.原料：4種脫氧核苷酸；3.引物：2種；4.DNA聚合酶；5.合適的反應(yīng)條件：pH、Mg2+等。模板DNA5～10μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)際為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μL1—5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μLH2O（無(wú)菌水）28～33μL總體積50μL注：模板DNA的用量為用量為1pg-1μg。（二）材料用具一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR6.

PCR反應(yīng)體系：知識(shí)鏈接：dNTP是指四種脫氧核苷酸三磷酸（dATP、dTTP、dGTP和dCTP）。脫氧核苷酸在DNA聚合酶催化新鏈合成的過(guò)程中，每摻入一個(gè)脫氧核苷酸，伴隨著兩個(gè)高能磷酸鍵的斷裂，由此釋放出的能量可以滿足脫氧核苷酸聚合反應(yīng)的需求。dNTP分子結(jié)構(gòu)示意圖下列關(guān)于PCR的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是（

單選

）A.PCR是體外復(fù)制DNA的技術(shù)B.PCR過(guò)程中只需要一個(gè)模板DNA、兩種引物分子、大量脫氧核苷酸原料C.TaqDNA聚合酶要具有耐高溫的特點(diǎn)D.PCR利用了DNA的熱變性原理答案：B（三）方法步驟視頻PCR操作一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR用微量移液器把PCR配方中各組分加入到微量離心管中。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。設(shè)置好PCR儀循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min移液離心擴(kuò)增（三）方法步驟預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。一、DNA片段的擴(kuò)增——PCR原理：材料用具：基本操作步驟：PCR小結(jié)瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物鑒定DNA半保留復(fù)制、DNA熱變性。PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性槍頭、PCR反應(yīng)體系配方。移液→離心→擴(kuò)增。（一）實(shí)驗(yàn)原理二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳1.電泳是指在電場(chǎng)作用下，帶電分子向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。

2.DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。相同長(zhǎng)度的DNA雙鏈具有等量的凈電荷，因此，同樣大小的DNA在電場(chǎng)中會(huì)以相同的速率向一極移動(dòng)。（一）實(shí)驗(yàn)原理二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳PCR產(chǎn)物——DNA的鑒定一般用瓊脂糖凝膠電泳。

在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。4.凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。下列有關(guān)電泳的敘述，不正確的是（

單選）

A．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程

B．待測(cè)樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA的遷移速率

C．進(jìn)行電泳時(shí)，帶電粒子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)

D．PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定答案：C1.電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）（二）材料用具二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳梳子制膠槽制膠板制膠工具（二）材料用具二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳2.電泳緩沖液：主要作用是維持合適的pH，以及使溶液具有一定的導(dǎo)電性以利于DNA的遷移。目前常用的有1×TAE和0.5×TBE緩沖液。內(nèi)含指示劑，PCR產(chǎn)物與其混合后再進(jìn)行加樣。凝膠載樣緩沖液：瓊脂糖核酸染料（三）方法步驟二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳視頻瓊脂糖凝膠電泳操作用電泳緩沖液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%—1.2%的瓊脂糖溶液，加熱至瓊脂糖熔化，稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子。凝膠溶液完全凝固后拔出梳子，形成加樣孔。取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳、觀察接通電源，待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。（三）方法步驟二、PCR產(chǎn)物的鑒定——電泳原理：材料用具：基本操作步驟：PCR小結(jié)原理：材料用具：基本操作步驟：瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物鑒定DNA半保留復(fù)制、DNA熱變性。PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性槍頭、PCR反應(yīng)體系配方。移液→離心→擴(kuò)增。電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖、核酸染料。配制瓊脂糖溶液→制備凝膠→加樣→電泳→觀察。電泳原理、影響凝膠中DNA分子遷移速率因素、染色檢測(cè)。1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在—20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不要隨意加大試劑用量。注意事項(xiàng):小結(jié)謝謝觀看！高二—人教版—生物學(xué)選擇性必修3—第3章基因工程的基本操作程序（第3課時(shí)）答疑同一塊凝膠中，DNA分子量大小與遷移速率的關(guān)系是怎樣的？同一塊凝膠中，DNA分子越大，遷移速率越慢，反之越快。結(jié)束電泳時(shí)，DNA分子越大，遷移距離越短，離點(diǎn)樣孔越近。判斷是否成功擴(kuò)增出DNA片段的依據(jù)是什么？（1）觀察DNA條帶的分布。如對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)參照物（Maker），可知擴(kuò)增出的DNA片段大小。（2）觀察DNA條帶的粗細(xì)程度。如果電泳鑒定結(jié)果沒(méi)有條帶，或不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。如果擴(kuò)增結(jié)果沒(méi)有條帶，即擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分；各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)；PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；復(fù)性溫度過(guò)低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。PCR實(shí)驗(yàn)中如何設(shè)置對(duì)照？對(duì)照1（陰性對(duì)照）：PCR反應(yīng)體系中不加入模板DNA，而是以無(wú)菌水補(bǔ)足總體積，其他成分不變。以排除反應(yīng)體系等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。對(duì)照2（陽(yáng)性對(duì)照）：PCR反應(yīng)體系中不加入模板DNA，而是加入已知的包含目的基因的片段，其他成分不變，以檢測(cè)PCR的效率。用PCR方法檢測(cè)