粒細胞集落刺激因子在妊娠中的調(diào)節(jié)機制及其在不明原因復發(fā)性流產(chǎn)治療中的研究進展

摘要不明原因復發(fā)性流產(chǎn)（unexplainedrecurrentspontaneousabortion，URSA）是婦科常見病及疑難病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。母-胎界面免疫耐受失衡是其重要原因之一。近年來的研究表明，粒細胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF）是一種參與調(diào)控母-胎界面免疫功能的細胞因子，在胚胎著床、胎盤及胎兒發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。本文就G-CSF在正常妊娠過程中的作用機制及其在URSA治療中應(yīng)用的研究進展做一綜述，以期為URSA病理機制和臨床干預技術(shù)的進一步研究提供參考?！娟P(guān)鍵詞】粒細胞集落刺激因子；不明原因復發(fā)性流產(chǎn)；免疫耐受

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrentspontaneousabortion，RSA）是指與同一性伴侶在妊娠20周內(nèi)發(fā)生2次或2次以上的妊娠丟失，其發(fā)病率為1%~5%，且有逐年上升的趨勢［1］。RSA的病因復雜，已明確的病因包括染色體、生殖解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌功能的異常、血栓因素、自身免疫性疾病及生殖道的感染，還有近50%的RSA患者找不到確切的病因，稱為不明原因復發(fā)性流產(chǎn)（unexplainedrecurrentspontaneousabortion，URSA）［2］。有研究表明，URSA與母-胎界面免疫耐受失衡有關(guān)［3］。因此，臨床上也相繼推出多種免疫治療方案，包括T淋巴細胞免疫、靜脈注射免疫球蛋白、環(huán)孢素等，均旨在修復妊娠期間特殊的母-胎界面免疫微穩(wěn)態(tài)。近年來的研究表明，粒細胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF）在女性生殖過程中起重要調(diào)節(jié)作用，參與維持母-胎界面免疫平衡，為妊娠相關(guān)疾病的治療提供了新靶點［4］。本文就G-CSF在正常妊娠母-胎界面調(diào)節(jié)作用機制及其在URSA等疾病治療中應(yīng)用的研究進展情況綜述如下。一.G-CSF的概述1.G-CSF的來源及分布：G-CSF屬于集落刺激因子家族，又稱集落刺激因子3（colonystimulatingfactor3，CSF3）是一種糖基化的多肽鏈細胞生長因子。G-CSF來源很廣泛，可由造血干細胞中的單核巨噬細胞系合成和分泌，也可由非造血細胞（成纖維細胞、單核細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、基質(zhì)細胞和骨髓細胞）產(chǎn)生［5］，甚至某些惡性腫瘤細胞中也有G-CSF的表達［6］。G-CSF家族還包括巨噬細胞集落刺激因子（macrophagecolony-stimulatingfactor，M-CSF；colonystimulatingfactor1，CSF1）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF；colonystimulatingfactor2，CSF2），而M-CSF和GM-CSF在多種哺乳動物妊娠早期的輸卵管和子宮中均有表達。此外G-CSF及其受體在人類輸卵管上皮細胞以及母-胎界面蛻膜基質(zhì)細胞和蛻膜巨噬細胞中均有表達［7］。G-CSF廣泛分布于人體組織和血液循環(huán)中。在正常生理狀態(tài)下，人外周血清中G-CSF含量較低，當人體處于感染或應(yīng)激等異常狀態(tài)時，其血清濃度會顯著升高［8］。2.G-CSF的生物學特點：G-CSF蛋白由174個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為18800，由位于17號染色體的q21-22區(qū)的單基因編碼，全基因長度約2.3kb，含有5個外顯子和4個內(nèi)含子。G-CSF與特異性受體結(jié)合后，才能發(fā)揮其生物學作用。人G-CSF受體是一種跨膜蛋白，由813個氨基酸構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為130000~150000。由于G-CSFRmRNA存在不同的剪接方式，有不同的翻譯產(chǎn)物，因而存在5種不同的異構(gòu)體［8］。G-CSF與G-CSFR結(jié)合后可形成四聯(lián)復合體，特異性調(diào)節(jié)粒系祖細胞產(chǎn)生中性粒細胞，刺激骨髓中性粒細胞的增殖和分化，并將骨髓中的造血干細胞動員至外周血中，還可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的分泌以促進血管的形成［9］。G-CSF還可通過與G-CSFR的結(jié)合激活多種信號轉(zhuǎn)導通路，其中，JAK2-STAT3是G-CSF重要的下游信號通路，JAK2-STAT3信號通路可誘導抗凋亡蛋白產(chǎn)生，減少細胞凋亡［10］。二.G-CSF在正常妊娠過程中的作用1.G-CSF對子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)作用（1）G-CSF調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化：妊娠是一個復雜的生理過程，起始于受精卵與子宮腔上皮細胞和間質(zhì)細胞的直接接觸，即胚胎著床。為了更好地適應(yīng)胚胎著床，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（endometrialstromalcells，ESCs）增殖分化為肥大、圓形、富含細胞質(zhì)且多核的蛻膜基質(zhì)細胞（decidualstromalcells，DSCs），此過程被定義為“蛻膜化”，受類固醇激素和多種細胞因子的調(diào)控。環(huán)磷酸酰胺（cyclicadenosinemonophosphate，cAMP）作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的第二信使，對激素誘導的蛻膜化至關(guān)重要，能顯著促進ESCs中催乳素（prolactin，PRL）的合成和分泌［11］。早有研究表明G-CSF可通過自分泌或旁分泌的方式促進cAMP介導的ESCs蛻膜化［12］。近年有研究表明血清G-CSF水平在促性腺激素刺激卵巢自發(fā)排卵或誘導排卵時可達到高峰，且顆粒細胞產(chǎn)生的卵泡內(nèi)G-CSF及其在卵泡液中的濃度均高于血清，提示G-CSF在卵泡環(huán)境中起旁分泌作用［13］。Tournaye等［14］通過酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）法測定278名體外受精婦女卵泡液中G-CSF濃度，證明了卵泡液G-CSF濃度與相應(yīng)胚胎的植入潛能有相關(guān)性，來自高G-CSF水平卵泡的胚胎，成功植入的概率比來自低G-CSF水平卵泡的胚胎高3.3倍。這兩項研究更佐證了排卵后卵泡液G-CSF可通過旁分泌方式調(diào)節(jié)ESCs蛻膜化，從而改善子宮內(nèi)膜容受性，以利于胚胎植入。除此之外，正常妊娠婦女的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞也可分泌G-CSF，高明霞等［15］通過對子宮內(nèi)膜容受性欠佳的患者宮內(nèi)灌注G-CSF的研究表明，G-CSF可通過促進白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor，LIF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）等細胞因子的表達來調(diào)節(jié)ESCs蛻膜化。Rezaee等［16］通過PCR檢測結(jié)果表明在小鼠胚胎植入前轉(zhuǎn)染含有G-CSF同家族重組GM-CSF的外周血單核細胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）可提高LIF、VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的mRNA表達水平，從而改善子宮內(nèi)膜容受性。（2）G-CSF調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜增殖與修復：子宮內(nèi)膜厚度也是預測子宮內(nèi)膜容受性的指標參數(shù)之一，當排卵期子宮內(nèi)膜厚度低于7mm時，妊娠成功的可能性極低［17］。近年Lian等［18］通過對271例薄型子宮內(nèi)膜（≤7?mm）的凍融胚胎移植（frozen-thawedembryotransfer，F(xiàn)ET）患者進行回顧性隊列研究，證明了宮內(nèi)灌注G-CSF的患者子宮內(nèi)膜厚度明顯增加（P<0.001）。在G-CSF對子宮內(nèi)膜增殖的作用機制研究方面，孫亞喃［19］通過對體外培養(yǎng)的人子宮內(nèi)膜細胞中加入不同濃度的G-CSF，研究得出G-CSF對子宮內(nèi)膜增殖的作用是通過促進子宮上皮細胞和基質(zhì)細胞中PCNA基因和SLP基因表達、調(diào)高Wnt信號通路上β-catenin蛋白的表達實現(xiàn)的。在動物研究方面，Liu等［20］采用20μL90%的乙醇宮內(nèi)灌注建立薄型子宮內(nèi)膜小鼠模型，觀察了G-CSF同家族的GM-CSF對子宮內(nèi)膜修復的影響。結(jié)果表明腹腔注射GM-CSF可明顯增加子宮內(nèi)膜厚度、子宮內(nèi)膜腺細胞Ki67的表達及著床部位數(shù)目，并顯著促進人子宮內(nèi)膜腺細胞的增殖和基質(zhì)細胞的遷移，且GM-CSF對子宮內(nèi)膜的修復作用是通過激活PI3K/Akt信號通路介導的。（3）G-CSF通過動員骨髓干細胞調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性：手術(shù)、感染等因素損傷子宮內(nèi)膜致使組織再生障礙或?qū)m腔粘連是降低子宮內(nèi)膜容受性的重要原因。間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstemcells，MSCs）具有成體干細胞的自我更新能力和多向分化潛能，可介導組織修復與再生［21］。研究表明人臍帶間充質(zhì)干細胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUMSC）移植可通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡和子宮內(nèi)膜uNK細胞表達改善卵巢早衰（prematureovarianfailure，POF）小鼠的子宮內(nèi)膜容受性［22］。曾有研究表明G-CSF可增加骨髓中間充質(zhì)干細胞和造血干細胞的數(shù)量［23］。近年的研究基于基因芯片的轉(zhuǎn)錄分析表明G-CSF可激活與透明質(zhì)酸代謝相關(guān)的多種信號通路，動員脂肪來源的骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemesenchymalstemcells，BMSC），對ADSCs的治療能力起直接的調(diào)節(jié)作用［24］。2.G-CSF對母-胎界面血管重鑄的調(diào)節(jié)作用（1）G-CSF通過激活滋養(yǎng)層細胞相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)血管重鑄：妊娠期間胎盤血流量會大幅度增加，為保證胎盤有充足的血液灌注，滿足胎兒的生長發(fā)育需要，母-胎界面子宮螺旋動脈會重鑄為薄壁、低阻力、高通量的血管。近年的研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF能有效降低妊娠早期RSA患者的子宮動脈阻力，通過改善子宮動脈高阻力促進母-胎界面的血管重鑄［25］。血管重鑄由絨毛外滋養(yǎng)層細胞（extravilloustrophoblastcells，EVTs）遷移到母體子宮蛻膜，并侵入到肌層的螺旋動脈壁內(nèi)啟動，EVTs侵入母體子宮肌層的過程類似于腫瘤細胞的遷移與侵襲，但不同的是，雖然EVTs的侵襲活性并不弱于腫瘤細胞，但在正常妊娠過程中，其侵入深度都能限制在子宮肌層的外1/3，過度侵入則會發(fā)生胎盤植入，而侵入不足則會導致著床失敗而流產(chǎn)，說明EVTs的侵入過程受到精細調(diào)控。文獻報道，G-CSF可通過激活以下信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞的增殖和侵襲活性［26］。PI3k/Akt信號通路屬于酪蛋白激酶受體型轉(zhuǎn)導通路，是滋養(yǎng)層細胞正常遷移與浸潤的一條關(guān)鍵通路，在HTR8/SVneo細胞中可以通過抑制PI3K/Akt信號通路從而抑制細胞的遷移和浸潤［27］。研究表明G-CSF可通過激活PI3K/Akt信號通路增加人滋養(yǎng)層細胞系細胞中MMP-2和VEGF的表達與分泌，MMP-2能降解子宮基底膜的膠原結(jié)構(gòu)、VEGF可促進胎盤血管的形成，從而增強人滋養(yǎng)細胞的侵襲能力［26］。另有研究表明，G-CSF可通過增強PI3K/AKT信號通路活性促進Bcl-2和VEGF的表達，減少細胞凋亡，增加血管內(nèi)皮細胞的管腔容量［28］。MAPK通路中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPKs）屬于保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，MAPKs有4條主要的分支路線：ErK、JNK、p38MAPK和ERK5。通過抑制p38MAPK信號通路可以抑制HTR8/SV-neo的遷移［29］。PI3K是Erk1/2和p38MAPK的上游調(diào)節(jié)因子，G-CSF可通過激活PI3K介導的磷酸化作用而活化滋養(yǎng)層細胞Erk1/2MAPK信號通路［26］，也可作用于p38MAPK信號通路促進整合素β1的表達［30］。整合素是一種跨膜的α/β異二聚體，在細胞外基質(zhì)和細胞內(nèi)肌動蛋白骨架之間起雙向聯(lián)絡(luò)作用，控制細胞骨架重塑，以及細胞的增殖、分化和遷移等。G-CSF還可通過促進細胞運動并誘導肌動蛋白骨架變化來調(diào)控滋養(yǎng)層細胞的遷移，其能誘導體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞出現(xiàn)偽足生長、細胞體收縮、細胞尾端和周圍基質(zhì)黏著解離等遷移表型的轉(zhuǎn)變［30］，而抑制G-CSF的表達能有效抑制妊娠早期滋養(yǎng)層細胞的侵襲［31］。（2）G-CSF通過抗氧化應(yīng)激作用調(diào)節(jié)血管重鑄：胎盤的發(fā)育可分為血管生成期和血管重鑄期兩個階段，在血管生成期，血管內(nèi)滋養(yǎng)細胞（endovasculartrophoblast，enEVT）逆行聚集成“栓子”，阻塞子宮螺旋動脈，造成生理性低氧狀態(tài)。而在血管重鑄期，enEVT栓溶解，絨毛間隙的血流量增加，平均氧分壓上升，相當于慢性間歇性低氧復氧，過程類似于缺血再灌注損傷，導致活性氧簇生成，抗氧化物質(zhì)被消耗而發(fā)生氧化應(yīng)激。過度的氧化應(yīng)激會導致滋養(yǎng)細胞老化凋亡，侵入過淺而影響血管重鑄。曾有研究為評價G-CSF對卵巢缺血再灌注損傷的影響，對48只成年雌性SD大鼠進行隨機對照實驗，對卵巢組織進行病理學測定的結(jié)果表明，與對照組相比，G-CSF可顯著降低總氧化狀態(tài)（totaloxidationstate，TOS）和氧化應(yīng)激指數(shù)（oxidativestressindex，OSI）的平均水平，從而預防大鼠卵巢缺血再灌注損傷［32］。在之后的研究中，Chen等［33］將hUMSC和G-CSF共同移植到肝損傷大鼠模型體內(nèi)，采用ELISA法檢測，結(jié)果表明hUMSC和G-CSF聯(lián)合治療可抑制氧化應(yīng)激、促炎細胞因子的產(chǎn)生和肝細胞凋亡來改善肝功能衰竭（liverfailure，LF）。近年的研究表明G-CSF可抑制腎小管細胞凋亡，并通過增加髓系抑制細胞（myeloidderivedsuppressorcells，MDSCs）數(shù)量，減輕腎缺血再灌注損傷后的急性腎損傷和慢性腎纖維化［34］。子癇前期的發(fā)病機制也與缺血再灌注損傷后導致炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激影響血管重鑄有關(guān)，有研究表明，與正常妊娠相比，子癇前期患者血清中G-CSF的表達下調(diào)，證實G-CSF抗氧化應(yīng)激和抑制促炎細胞因子產(chǎn)生的作用參與調(diào)節(jié)母-胎界面的血管重鑄［35］。3.G-CSF對母-胎界面免疫細胞功能的調(diào)節(jié)作用：妊娠對于母體來說是一個半同種異體移植的過程，胎兒攜有遺傳自父系的HLA抗原，而未引發(fā)母體對胎兒的排斥有賴于母體免疫系統(tǒng)對胚胎抗原的免疫耐受。蛻膜免疫細胞是母-胎免疫耐受機制的基礎(chǔ)，主要包括蛻膜自然殺傷細胞（decidualnaturalkillercell，dNK）、T淋巴細胞、巨噬細胞等。（1）G-CSF對NK細胞的調(diào)節(jié)作用：NK細胞包括外周血NK細胞（peripheralbloodnaturalkillercells，pNK）和dNK，研究表明RSA患者血清中存在較高的NK細胞水平，pNK細胞數(shù)量增多、細胞毒性增強是導致RSA的危險因素［36］。近年一項回顧性研究的血清學檢測指標表明G-CSF可降低pNK細胞的百分比［25］。另有研究表明G-CSF可顯著降低外周血中干擾素-γ（IFN-γ）分泌型NK細胞1（naturalkiller1，NK1）的數(shù)量［37］。與pNK細胞不同，妊娠早期，dNK細胞數(shù)量會迅速增加，約占淋巴細胞總量的70%，研究表明dNK可通過分泌G-CSF、GM-CSF等細胞因子來調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層的侵襲和螺旋動脈的重塑［38］。G-CSF還可通過募集dNK細胞誘導母-胎免疫耐受，并調(diào)節(jié)dNK細胞的細胞毒性，減少INF-γ和IL-18等細胞因子的產(chǎn)生［39］。（2）G-CSF對T淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用：T淋巴細胞主要包括輔助性T（Thelper，Th）淋巴細胞和調(diào)節(jié)性T（regulatoryT，Treg）淋巴細胞，母-胎免疫耐受的機制為Th1/Th2平衡向Th2偏移、Th17/Treg平衡向Treg偏移。研究表明G-CSF可使有RSA病史的早孕婦女血清中CD3+T淋巴細胞增加、CD3+CD4+Th淋巴細胞百分比增加，可使Th1/Th2平衡向Th2偏移，另外可以活化幼稚CD4+T淋巴細胞，同時使CD4+效應(yīng)記憶和終末分化的效應(yīng)T細胞中CD3+T細胞和CD8+T細胞的百分比顯著上調(diào)［25］。Scarpellini等［4］通過免疫組織化學法，與正常妊娠和未經(jīng)G-CSF治療的URSA流產(chǎn)患者進行比較，評估了G-CSF對URSA患者蛻膜的治療效果，G-CSF治療增加了蛻膜中表達Foxp3的細胞濃度，F(xiàn)oxp3是Treg細胞的特異性標記，而在未經(jīng)治療的URSA患者蛻膜中，這些細胞減少。表明G-CSF可誘導Treg細胞的發(fā)育，并動員骨髓中的Treg細胞轉(zhuǎn)移到蛻膜。G-CSF還可抑制IL-2對人體蛻膜淋巴細胞的溶解作用［39］。另有研究為探討G-CSF動員的異基因外周血干細胞移植（allogeneicperipheralbloodstemcelltransplantation，allo-PBSCT）急性移植物抗宿主?。╝cutegraftversushostdisease，aGVHD）發(fā)生率較低的具體機制，檢測G-CSF治療前后供體外周血γδTreg亞群的表達，結(jié)果表明G-CSF治療后外周血中Vδ1Tregs、CD27+Vδ1Tregs和CD25+Vδ1Tregs的比例顯著增加［40］。G-CSF是通過對T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用使aGVHD發(fā)生率降低的。（3）G-CSF對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用：蛻膜巨噬細胞（dMΦs）是重要的抗原呈遞細胞，能夠維持免疫耐受和免疫應(yīng)答之間的平衡。其分為兩種表型M1和M2，M1表型具有促炎作用，M2表型可發(fā)揮免疫抑制作用。為促進對胎兒的免疫耐受，母-胎界面應(yīng)以M2表型dMΦs為主。Seledtsov等［41］研究了G-CSF對MΦs表型的直接影響。結(jié)果表明G-CSF可抑制MΦs向M1表型的極化，有利于M2表型極化，并可下調(diào)MΦs中IFN-γ受體的表達和刺激IL-6的產(chǎn)生。另有研究表明G-CSF同家族的M-CSF可將dMΦs誘導分化為M2表型［42］。三.G-CSF在URSA和復發(fā)性種植失?。╮ecurrentimplantationfailure，RIF）臨床治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀Scarpellini等［43］2009年首次報道應(yīng)用重組人G-CSF（recombinanthumanG-CSF，rhG-CSF）治療URSA的一項隨機對照試驗，共納入了68名URSA患者，將患者隨機分為兩組，對于治療組在排卵后第6日起開始皮下注射rhG-CSF（n=35）（1μg·kg-1·d-1）治療，直到月經(jīng)來潮或妊娠9周，對照組則在相同的時間應(yīng)用安慰劑（生理鹽水）（n=33）進行治療。最后以分娩健康嬰兒的妊娠結(jié)局為主要的結(jié)局衡量標準。結(jié)果顯示治療組的35名女性中有29名（82.8%）產(chǎn)下健康嬰兒，而對照組中僅有16名（48.5%）（P=0.0061），且應(yīng)用rhG-CSF治療的孕婦在妊娠期間的β-hCG水平明顯高于對照組（P<0.001）。臨床中rhG-CSF的給藥方式除了皮下注射，還有宮腔內(nèi)灌注的方式。Davari-tanha等［44］對100名RIF患者進行了隨機雙盲安慰劑對照試驗。在卵母細胞穿刺當天或孕酮給藥的FET周期宮內(nèi)注射300μgrhG-CSF，相同時間注射生理鹽水及安慰劑，共分rhG-CSF組40例、生理鹽水組40例、安慰劑組20例，結(jié)果顯示rhG-CSF可提高化學妊娠率和植入率。以上兩項臨床研究在排卵日或后6d開始給藥，而Eapen等［45］對150名URSA患者進行了一項為期近兩年的雙盲安慰劑隨機對照試驗，分為rhG-CSF組76例、安慰劑組74例。從妊娠3~5周開始每日皮下注射130μgrhG-CSF或相同的安慰劑，最多持續(xù)到9周。結(jié)果顯示與安慰劑組相比，rhG-CSF沒有提高臨床妊娠率。作者認為這個結(jié)果可能與納入組別時，對RSA患者未進行排除其他明確非免疫病因致病者有關(guān)。Kamath等［46］對2019年2月以前15項比較G-CSF給藥與不給藥或安慰劑對接受IVF治療婦女療效影響的隨機對照試驗進行meta分析，共包括622名接受