酶的海藻酸鈉法包埋固定化

生物與化工學(xué)院教案 生物與化工學(xué)院教案課程名稱海洋生物技術(shù)(實訓(xùn))教學(xué)內(nèi)容（項目)酶的海藻酸鈉法包埋固定化授課進度實訓(xùn)教學(xué)日期及課節(jié)共（4）學(xué)時教學(xué)地點實訓(xùn)室教學(xué)目標1.能按規(guī)程進行生產(chǎn)操作；2.會做清場清潔工作；3.會填原始記錄；4.會對生產(chǎn)中出現(xiàn)的問題進行正確判斷和分析；5.掌握果膠酶的海藻酸鈉包埋固定化方法6.掌握果膠酶的活力測定原理與方法教學(xué)重點1、掌握果膠酶的活力測定原理與方法2、掌握果膠酶的海藻酸鈉包埋固定化方法。教學(xué)難點1、掌握果膠酶的活力測定原理與方法2、掌握果膠酶的海藻酸鈉包埋固定化方法。教學(xué)設(shè)計教學(xué)環(huán)節(jié)時長（分鐘）教學(xué)過程及內(nèi)容設(shè)計教學(xué)方法講解20分鐘一.實驗原理固定化細胞或酶即利用物理或化學(xué)方法將細胞或酶固定在一定空間的技術(shù)。果膠酶的固定化由于酶具有高效催化作用，果膠酶被廣泛應(yīng)用于食品加工和釀酒等工業(yè)中。目前，果膠酶已成為世界四大酶制劑之一。盡管如此，不少與應(yīng)用有關(guān)的問題仍有待解決。如酶的穩(wěn)定性差，在溫度、pH值和無機離子等因素的影響下容易失去活性；酶在水中與底物進行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶即使還有活性也難于分離和再利用，因而生產(chǎn)成本高；同時，酶很難從反應(yīng)體系當中分離出來用于連續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)；酶反應(yīng)的產(chǎn)物與底物同時存在于同一反應(yīng)體系中，反應(yīng)后，酶的存在使得產(chǎn)物的分離純化難度加大，雜質(zhì)含量高。由于這些不足之處，使酶的應(yīng)用范圍受到一定的限制，使果膠酶的潛力未能充分發(fā)揮出來，固定化酶提供了解決問題的方法。在果膠酶的固定化中，對各種固定化方法都作了一些嘗試，北京師范大學(xué)張來群用尼龍網(wǎng)作載體，經(jīng)3一二甲氨基丙胺活化，用戊二醛將果膠酶固定化；福建省亞熱帶植物研究所劉新民用海藻酸鈉、二醋酸纖維和明膠分別作為載體，對果膠酶進行了固定化；吉林大學(xué)的張應(yīng)玖用重氮化的對一氨基苯磺酰乙基纖維素為載體，制備固定化果膠酶；靳曉紅用離子交換樹脂對果膠酶進行固定化；浙江大學(xué)朱祥瑞等人把家蠶絲素分別與果膠酶通過吸附以及與戊

二醛交聯(lián)結(jié)合，制備了不同形狀固定化酶；陳峰等人比較了不同載體通過吸附和包埋法對米曲霉C491果膠酶進行固定化；李秀錦等人以殼聚糖為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，研究了果膠酶的固定化；王宏等人利用海藻酸鈉為載體固定化果膠酶。果膠酶的固定化將有助于提高酶的利用率，同時還可減少外源物質(zhì)對果制品的污染。然而固定化酶的性能除取決于固定化方法外，還取決于在固定化中所使用的載體。酶固定化對載體材料具有很高的要求，如要有良好的機械強度、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性、良好的抗微生物特性及酶的結(jié)合能力等。討論法分工、試劑配制等20分鐘二.實驗器材果膠酶，無水CaCl2，海藻酸鈉，玻璃棒，200mL燒杯，榨汁機，水浴鍋，水果，容量瓶100毫升，試管，試管架，離心機，離心管，電子天平，膠頭滴管，移液管，吸耳球，一次性注射器講授法,演示法教學(xué)環(huán)節(jié)時長（分鐘）教學(xué)過程及內(nèi)容設(shè)計教學(xué)方法教師演示與學(xué)生實操120分鐘三．實驗步驟1．配制2%果膠酶溶液2．配制濃度為0.05mol/L的CaCl2溶液：稱取無水CaCl20.83g，放入200mL的燒杯中，加入150mL的蒸餾水，使其充分溶解，待用。3．配制海藻酸鈉溶液：稱取0.7g海藻酸鈉，放入50mL小燒杯中.加人10mL水，用酒精燈加熱，邊加熱邊攪拌，將海藻酸鈉調(diào)成糊狀，直至完全溶化，用蒸餾水定容至10mL。注意，加熱時要用小火，或者間斷加熱，反復(fù)幾次，直到海藻酸鈉溶化為止。海藻酸鈉的濃度涉及到固定化酶的質(zhì)量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酶少，影響實驗效果。4．海藻酸鈉溶液與果膠酶混合：將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入果膠酶溶液，進行充分攪拌，使其混合均勻，再轉(zhuǎn)移至注射器中。5．固定化酶：以恒定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，觀察液滴在CaCl2溶液中形成凝膠珠的情形。將這些凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。剛形成的凝膠珠應(yīng)在CaCl2溶液中浸泡一段時間，以便形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。檢驗?zāi)z珠的質(zhì)量是否合格，可以使用下列方法：一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手擠壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。觀察凝膠珠的顏色和形狀:如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。6．固定化酶活測定：參照實訓(xùn)三果膠酶對果汁的澄清效果檢驗Ⅰ：取五支18*180試管，其中一支標為空白管，4支標為試驗管，分別向五支試管中加入稀釋10倍的果汁10ml。Ⅱ：五支試管于45℃水浴鍋中保溫10min。Ⅲ：向4支試管中分別加入果膠酶液1ml，固定化果膠酶1毫升，空白管不加。Ⅳ：五支試管于45℃水浴鍋中精確保溫10min。Ⅴ：反應(yīng)完后，迅速取出，將反應(yīng)液倒入離心管中離心（4000r/min）5min。Ⅵ：以蒸餾水為參照比，在660nm測透光率。T透光率=︳T樣品-T空白︱四、結(jié)果分析1．固定化果膠酶酶活比較（Excel做柱形圖）2.酶活力回收率的測定：酶活力回收率=固定化酶的酶活÷酶液初始總酶活×100％思考：固定化酶的優(yōu)點多媒體教學(xué)；講授法；討論法思維碰撞20分鐘討論-思維碰撞（作業(yè)）1實訓(xùn)結(jié)果展示交流與討論.2在分組實訓(xùn)中，若失敗，利用課后討論及利用課余時間實訓(xùn)。3課后做出詳細結(jié)果分析并寫出書面總結(jié)報告。討論法教學(xué)意見及建議：《海洋生物技術(shù)》是一門理實一體化的跨專業(yè)選修課程，采用基于數(shù)字化教學(xué)平臺的翻轉(zhuǎn)課堂教學(xué)模式，有QQ群師生交流平臺，多師同堂。課堂采用多媒體教學(xué)、講授法、研討法、直觀教學(xué)。采用工作任務(wù)驅(qū)動，項目導(dǎo)向的案例教學(xué)法