《肝素酶活性的測(cè)定》編制說(shuō)明

《肝素酶活性的測(cè)定分光光度法》中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)

會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明

一、工作簡(jiǎn)況

（一）任務(wù)來(lái)源

肝素酶可以催化肝素或者硫酸乙酰肝素的裂解反應(yīng)，分為肝素酶

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其最重要的用途之一是酶解肝素制備低分子量肝素，而

低分子量肝素是最重要的抗凝血藥物之一。肝素酶的酶活性是其質(zhì)量

的重要指標(biāo)之一，鑒于目前我國(guó)并無(wú)統(tǒng)一的肝素酶活性測(cè)定的方法標(biāo)

準(zhǔn)，產(chǎn)品的實(shí)際酶活性和包裝標(biāo)識(shí)的酶活性是否一致還缺乏相關(guān)的標(biāo)

準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范約束和驗(yàn)證，因此研制肝素酶活性的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)將為肝素酶

的生產(chǎn)、流通及監(jiān)管提供依據(jù)，促進(jìn)我國(guó)肝素行業(yè)以及肝素酶相關(guān)醫(yī)

藥行業(yè)的健康發(fā)展，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。根據(jù)行業(yè)的現(xiàn)實(shí)需求，

清華大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、清華大學(xué)深圳國(guó)際研究生院、北京碧

澄生物科技有限公司、深圳灣實(shí)驗(yàn)室、蘇州大學(xué)于2021年8月聯(lián)合提

出《肝素酶活性的測(cè)定分光光度法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃，并確定由清華

大學(xué)牽頭承擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)起草任務(wù)。

2022年2月，經(jīng)中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)組織專家通過(guò)批準(zhǔn)立項(xiàng)，

立項(xiàng)名稱為《肝素酶活性的測(cè)定分光光度法》。

（二）標(biāo)準(zhǔn)的起草單位及起草人

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：清華大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院、清華大學(xué)深圳

國(guó)際研究生院、北京碧澄生物科技有限公司、深圳灣實(shí)驗(yàn)室、蘇州大

學(xué)。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王怡、蘇楠、吳希、邢新會(huì)、張翀、徐冰、

云振宇、吳琦、趙琳、張真慶。

（三）主要工作過(guò)程

1.預(yù)階段

2021年8月至2022年1月，標(biāo)準(zhǔn)起草單位組織相關(guān)技術(shù)人員對(duì)《肝

素酶活性的測(cè)定分光光度法》標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目進(jìn)行了預(yù)研，對(duì)肝素酶Ⅰ、

Ⅱ、Ⅲ的活性測(cè)定條件進(jìn)行了摸索，初步確立了肝素酶活性的測(cè)定方

法。標(biāo)準(zhǔn)起草組向中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)提交了標(biāo)準(zhǔn)建議書與標(biāo)準(zhǔn)草

案，進(jìn)行申報(bào)立項(xiàng)。

2.立項(xiàng)階段

2022年2月，中國(guó)生化制藥工業(yè)協(xié)會(huì)正式通過(guò)本團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)。

3.起草階段

針對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目，正式成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，明確了任務(wù)要

求，安排了工作進(jìn)度，根據(jù)單位參與的人員的專業(yè)、技能、人數(shù)將任

務(wù)合理分配。依據(jù)GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)

化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)一步完善的同時(shí)，開展技術(shù)

指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作。

在此期間，嚴(yán)格遵守國(guó)家新型冠狀病毒感染肺炎疫情防治工作的

要求，通過(guò)電話會(huì)議形式開展了5次工作會(huì)議。會(huì)議就標(biāo)準(zhǔn)制定的相

關(guān)問(wèn)題進(jìn)行了協(xié)商與研究，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的框架及內(nèi)容進(jìn)行了認(rèn)真研究和

討論。由此形成了最終的《肝素酶活性的測(cè)定分光光度法》團(tuán)體標(biāo)

準(zhǔn)征求意見稿和編制說(shuō)明。

二、確定標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

堅(jiān)持嚴(yán)要求、適宜性與可操作性相結(jié)合的原則。嚴(yán)要求即標(biāo)準(zhǔn)的

編制嚴(yán)格遵循GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文

件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》及相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行；適宜性既要充分考慮

到本行業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與特點(diǎn)，又要有一個(gè)適宜的范圍與程度,從而提

高標(biāo)準(zhǔn)貫徹實(shí)施的可操作性。

（二）本標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

1.主體內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容包括：范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、

原理、試劑、儀器設(shè)備、試樣制備和試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、精密

度以及試驗(yàn)報(bào)告。

2.范圍

本文件描述了測(cè)定肝素酶活性的分光光度法。本文件適用于生化

試劑、工業(yè)酶制劑中肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的測(cè)定。

3.規(guī)范性引用文件

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。

4.術(shù)語(yǔ)和定義

對(duì)肝素酶活性單位進(jìn)行了定義，是在30℃、pH7.0的條件下，每

分鐘產(chǎn)生1μmol4,5-不飽和糖醛酸所需的酶量。一個(gè)酶活性單位以U

表示。

5.原理

肝素酶催化底物肝素或硫酸乙酰肝素裂解會(huì)生成4,5不飽和糖醛

酸。4,5不飽和糖醛酸在232nm波長(zhǎng)下有特征吸收（圖1），通過(guò)監(jiān)測(cè)

232nm下的吸光度的變化來(lái)測(cè)定4,5不飽和糖醛酸的生成速率，計(jì)算

酶活性。

圖1肝素酶催化生成的4,5不飽和糖醛酸的全波長(zhǎng)掃描圖

6.肝素酶酶活性測(cè)定方法的確立

由于酶的活性會(huì)受到溫度、pH以及離子添加劑等多種參數(shù)的影

響，因此選取不同溫度、不同pH、不同CaCl2濃度條件對(duì)肝素酶Ⅰ、

Ⅱ、Ⅲ的活性進(jìn)行測(cè)定，以確定酶的活性測(cè)定方法中的各項(xiàng)重要參數(shù)。

此外，反應(yīng)時(shí)間也會(huì)影響酶活性測(cè)定的結(jié)果，因此該參數(shù)也需在方法

中確立。

6.1反應(yīng)溫度的確定

肝素酶等酶的催化作用受溫度的影響很大，一方面提高溫度可以

增加酶促反應(yīng)的速度，另一方面酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度過(guò)高可

引起蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致酶的失活。

不同溫度對(duì)肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的影響如圖2所示。肝素酶Ⅰ

和肝素酶Ⅱ的最適催化溫度為30℃，而肝素酶Ⅲ的活性在20℃-40℃

的范圍內(nèi)隨溫度提高而緩慢提高，綜合考慮三種肝素酶的熱穩(wěn)定性，

在標(biāo)準(zhǔn)文本中確定選取30℃為肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的活性測(cè)定溫度。

圖2肝素酶的酶活性隨溫度的變化

6.2反應(yīng)pH的確定

反應(yīng)體系pH值對(duì)于肝素酶等酶的活性影響很大，pH的改變能影

響酶活性中心上必須基團(tuán)的解離程度，同時(shí)也能影響底物的解離程度，

從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化。而當(dāng)pH過(guò)?。ㄟ^(guò)酸）或者

過(guò)大（過(guò)堿）都有可能使蛋白變性而失活。

不同pH對(duì)肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性的影響如圖3所示。肝素酶I和Ⅲ

均能在pH6.0-7.0的范圍內(nèi)保持較高的活性，而肝素酶Ⅱ的最適pH為

7.0，三種肝素酶在pH為9.0的條件下迅速失活。對(duì)于三種肝素酶，選

取pH7.0為活性測(cè)定的pH。

圖3肝素酶的酶活性隨pH的變化

6.3離子添加劑CaCl2濃度的確立

前期研究表明鈣離子是肝素酶活性所必需的輔助因子。CaCl2濃

度對(duì)三種肝素酶的活性影響如圖4所示，其中三種肝素酶在CaCl2濃度

為0時(shí)的活性分別設(shè)為100%。CaCl2的加入使得三種肝素酶的活性均

有所提高，在CaCl2濃度為1.2-5.0mM的范圍內(nèi)，鈣離子的濃度對(duì)三種

肝素酶的酶活性影響不大，因此在標(biāo)準(zhǔn)文本中選取1.2mM為肝素酶

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性測(cè)定時(shí)的CaCl2濃度。

圖4肝素酶的酶活性隨CaCl2濃度的變化

6.4反應(yīng)時(shí)間的確立

肝素酶活性測(cè)定過(guò)程中吸光度隨時(shí)間的變化曲線如圖5所示。為

保證酶活性測(cè)定的準(zhǔn)確性，并且不遺漏活性測(cè)定過(guò)程中的重要數(shù)據(jù)，

活性測(cè)定時(shí)間為20min，在此時(shí)間范圍內(nèi)，三種肝素酶催化生成的底

物吸光度呈線性增加的趨勢(shì)。應(yīng)選取曲線平滑且線性的60s區(qū)段，通

過(guò)線性回歸方程計(jì)算斜率從而計(jì)算酶活性。

圖5肝素酶活性測(cè)定過(guò)程中的吸光度變化

7.試劑

本標(biāo)準(zhǔn)給出了肝素酶活性的測(cè)定方法中所使用的試劑的清單，包

括肝素鈉、硫酸乙酰肝素、鹽酸溶液、肝素酶Ⅰ及肝素酶Ⅱ的反應(yīng)底

物溶液以及肝素酶Ⅲ的反應(yīng)底物溶液。描述了試劑的主要特性，并給

出了溶液的制備方法。

對(duì)于肝素酶Ⅰ和Ⅱ活性的測(cè)定，底物溶液含20mmol/L三羥基甲

基氨基甲烷（Tris）、1.2mmol/L氯化鈣（CaCl2）、150mmol/L氯化

鈉（NaCl）及8.3g/L肝素鈉，pH7.0；對(duì)于肝素酶Ⅲ活性的測(cè)定，底

物溶液含20mmol/LTris、1.2mmol/LCaCl2、150mmol/LNaCl及16.7

g/L硫酸乙酰肝素，pH7.0。

8.儀器設(shè)備

本標(biāo)準(zhǔn)給出了肝素酶活性的測(cè)定方法中所使用的儀器設(shè)備的清

單，并描述了主要特性。儀器設(shè)備包括分析天平、pH計(jì)、紫外-可見

分光光度計(jì)、恒溫水浴槽、磁力攪拌器、石英比色皿、容量瓶、燒杯、

量筒以及移液器。

9.試樣制備和試驗(yàn)步驟

由于市售的肝素酶包含液體樣品和固體樣品兩種形態(tài)，因此在試

樣酶液的制備中分為液體樣品待測(cè)酶液制備和固體樣品待測(cè)酶液制

備兩部分。

酶活性的測(cè)定步驟為：準(zhǔn)確移取1mL反應(yīng)底物溶液于石英比色皿

中，置于分光光度計(jì)的保溫槽內(nèi)，待溫度穩(wěn)定于30℃后，迅速加入10

μL待測(cè)酶液，加蓋顛倒混勻后立即放入分光光度計(jì)，在232nm下掃描

20min，保存吸光度曲線。選取曲線平滑且線性的60s區(qū)段，通過(guò)線

性回歸方程計(jì)算斜率。

10.試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

分為液體樣品和固體樣品兩部分。

10.1液體樣品

試樣中肝素酶活性按式（1）計(jì)算：

()××

=························(1)

×

????1+????2????????

????1????????2

式中：

X1——肝素酶活性，單位為酶活性單位每毫升（U/mL）

V1——反應(yīng)底物溶液的體積，單位為微升（μL）；

V2——酶活性測(cè)定中加入酶液的體積，單位為微升（μL）；

k——酶活性測(cè)定中吸光度曲線斜率，單位為吸光度每分鐘

（Abs/min）；

D——稀釋倍數(shù)；

ε——吸光系數(shù)，單位為mM-1cm-1（取值為3.8mM-1cm-1）。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

10.2固體樣品

試樣中肝素酶活性按式（2）計(jì)算：

()×

=×·······················(2)

×

????1+????2????????0

式中：????2????????2m

X2——肝素酶活性，單位為酶活性單位每克（U/g）

V1——反應(yīng)底物溶液的體積，單位為微升（μL）；

V2——酶活性測(cè)定中加入酶液的體積，單位為微升（μL）；

k——酶活性測(cè)定中吸光度曲線斜率，單位為吸光度每分鐘

（Abs/min）；

ε——吸光系數(shù)，單位為mM-1cm-1（取值為3.8mM-1cm-1）；

V0——溶解酶粉的液體體積，單位為毫升（mL）；

m——稱取酶粉的質(zhì)量，質(zhì)量為克（g）。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

11.精密度

取同一樣品，相同條件下連續(xù)測(cè)定3次，結(jié)果如表1所示。肝素

酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶活性的RSD分別為0.53%、2.2%與1.8%，說(shuō)明重

復(fù)性好?；谝陨现貜?fù)性結(jié)果，在標(biāo)準(zhǔn)文本中規(guī)定了精密度為：在

重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)算數(shù)平均

值10%。

表1重復(fù)性條件下的酶活性測(cè)定數(shù)據(jù)

酶酶活性1酶活性2酶活性3平均酶活性RSD

（U/mL）（U/mL）（U/mL）（U/mL）

肝素酶Ⅰ10.810.910.910.90.53%

肝素酶Ⅱ11.011.010.610.92.2%

肝素酶Ⅲ10.911.311.111.11.8%

12.試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列內(nèi)容：a)試樣本身必要的詳細(xì)說(shuō)明；b)本

文件的編號(hào)；c)分析結(jié)果；d)測(cè)定過(guò)程中存在的任何異常情況；e)

試驗(yàn)日期、試驗(yàn)報(bào)告出具日期、實(shí)驗(yàn)室名稱和地址。

（三）本標(biāo)準(zhǔn)制定參考的主要依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程中參考了以下相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：GB/T33409-2016《β-半

乳糖苷酶活性檢測(cè)方法分光光度法》、GB/T34222-2017《核糖核酸

酶活力檢測(cè)方法》、GB/T35538-2017《工業(yè)酶制劑測(cè)定技術(shù)導(dǎo)則》。

三、主要試驗(yàn)（驗(yàn)證）的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期

的經(jīng)濟(jì)效果；

（一）主要試驗(yàn)（驗(yàn)證）的分析

1.起草組依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)草案中擬定的肝素酶活性檢測(cè)方法開展了驗(yàn)

證實(shí)驗(yàn)。收集了市場(chǎng)上三個(gè)不同廠家的肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶

Ⅲ，按照本標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)其酶活性進(jìn)行了測(cè)定，所得結(jié)果如表2所示。

結(jié)果表明，所有的肝素酶均能測(cè)出活性，且測(cè)得酶活性與標(biāo)稱酶活性

的比例均在60%以上，表明該方法具有較強(qiáng)的適用性。而由于不同廠

家檢測(cè)條件不同，各廠家生產(chǎn)的肝素酶的酶學(xué)特性存在差異，因此標(biāo)

識(shí)與本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果也會(huì)存在差異。這也進(jìn)一步說(shuō)明建立統(tǒng)一的肝素

酶活性測(cè)定方法具有重要意義。

表2.不同廠家的三種肝素酶的活性測(cè)定

測(cè)得酶活性標(biāo)

標(biāo)稱酶活性測(cè)得酶活性/

酶廠家稱酶活性

（U/mL）（U/mL）

（%）

肝素酶Ⅰa10.011.7117

肝素酶Ⅰb0.832.0241

肝素酶Ⅰc10.07.575

肝素酶Ⅱa15.014.798

肝素酶Ⅱb0.1670.1166

肝素酶Ⅱc15.011.979

肝素酶Ⅲa11.0