2024北京高考刺 基因工程 練習(xí)含答案

2024北京高考刺基因工程練習(xí)

1.科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部

分結(jié)構(gòu)如圖甲所示。其中內(nèi)編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。

啟動(dòng)了J基因15編碼序列終止子

L'谷a鏈

注：FL注、Fl、R2表示引物

抗J蛋白抗體抗V5抗體

圖乙

（1）與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體,

質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有（答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可）o

⑵構(gòu)建重組質(zhì)粒后,為了確定/基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR

檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物,應(yīng)選擇圖甲中的引物。已知/基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈

位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中/基因的（填“a鏈”或“b鏈”）

相應(yīng)部分的序列相同。

（3）重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后,用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相

應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表

達(dá)了，條帶2所檢出的蛋白（填“是”或“不是”）由重

組質(zhì)粒上的./基因表達(dá)的。

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答案（DRNA聚合酶標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)（或限制性酶切位點(diǎn)）（2）F2和

R1（或“F1和R2"）a鏈（3）JT5融合蛋白不是

解析（1）啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。

質(zhì)粒作為載體,需要有復(fù)制原點(diǎn)、一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)和便于重組質(zhì)粒篩

選的標(biāo)記基因等。（2）用PCR擴(kuò)增分析法確定重組質(zhì)粒中目的基因插入方向是否

正確時(shí)，常設(shè)計(jì)一對(duì)引物，一個(gè)引物與目的基因序列互補(bǔ)，另一個(gè)引物與質(zhì)粒序列

互補(bǔ)，兩引物延伸方向相反，以擴(kuò)增出兩引物間的序列，若插入方向正確，則可擴(kuò)

增出相應(yīng)序列，反之，則不能擴(kuò)增出相應(yīng)序列，故選用的引物應(yīng)為F2、R1或F1、

R2,若選用引物FL,R1,不論目的基因插入方向是否正確，都可擴(kuò)增出目的基因序

列。因?yàn)镴基因的b鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，啟動(dòng)子在左側(cè),所以轉(zhuǎn)錄方向?yàn)閺淖蟮接?

由于轉(zhuǎn)錄沿模板鏈3'到5'端方向合成RNA,所以/基因b鏈左側(cè)為3'端，引物要

與DNA的3,端互補(bǔ)配對(duì),所以F1與b鏈互補(bǔ),a鏈也與b鏈互補(bǔ)，由此推知引物

F1與a鏈相應(yīng)部分序列相同。（3）抗J蛋白抗體和抗V5抗體均能檢測(cè)到條帶1,

說(shuō)明條帶1為JT5融合蛋白，條帶2僅能由抗J蛋白抗體檢測(cè)至％說(shuō)明該蛋白僅

含J蛋白，不含V5標(biāo)簽,故條帶2檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的，基因表達(dá)的。

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2.基因遞送是植物遺傳改良的重要技術(shù)之一,我國(guó)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作開(kāi)發(fā)了一種新

型基因遞送系統(tǒng)(切一浸一生芽Cut-Dip-Budding,簡(jiǎn)稱(chēng)CDB法)。圖1與圖2分

別是利用常規(guī)轉(zhuǎn)化法和CDB法在某植物中遞送基因的示意圖。

植株A?外植體一愈傷組織一愈傷組織與含重組載

生芽、生根

蹄選"防畫(huà)f熊花

體的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)

植株A

圖1

切斷根莖

連接處

1植株上半部分

浸入含重組載

盆栽

體的農(nóng)桿菌液I1植株長(zhǎng)出

篩選r

毛狀根|剪切］陽(yáng)甬目

生芽

狀根段I盆三防畫(huà)一度花

植株B

圖2

回答下列問(wèn)題。

(1)圖1中，從外植體轉(zhuǎn)變成愈傷組織的過(guò)程屬于;從愈傷組織到幼苗的

培養(yǎng)過(guò)程需要的激素有生長(zhǎng)素和,該過(guò)程還需要光照，其作用

是O

(2)圖1中的愈傷組織，若不經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)環(huán)節(jié),直接誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的植株可以保持

植株A的。圖1中，含有外源基因的轉(zhuǎn)化植株A若用于生產(chǎn)種子,

其包裝需標(biāo)注o

⑶圖1與圖2中，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí),可將外源基因遞送到植物細(xì)胞中的原

因

是__________________________________________________________________

⑷已知某酶(PDS)缺失會(huì)導(dǎo)致植株白化。某團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了用于敲除基因的

CR1SPR/Cas9基因編輯載體(含有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因)，利用圖2中的CDB法

將該重組載體導(dǎo)入植株B,長(zhǎng)出毛狀根,成功獲得轉(zhuǎn)化植株B。據(jù)此分析,從毛狀根

中獲得陽(yáng)性毛狀根段的方法是，圖2中，鑒定導(dǎo)入

幼苗中的基因編輯載體是否成功發(fā)揮作用的方法

是,依據(jù)

是。

⑸與常規(guī)轉(zhuǎn)化法相比，采用CDB法進(jìn)行基因遞送的優(yōu)點(diǎn)是

(答出2點(diǎn)即可)。

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答案（1）脫分化細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)葉綠素的形成，使幼苗能夠進(jìn)行光合作用

⑵遺傳特性轉(zhuǎn)基因種子（3）農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，

能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移并整合到受體細(xì)胞染色體DNAI:（4）檢測(cè)毛狀根段

是否有綠色熒光植物PDS中靶區(qū)域測(cè)序（或根據(jù)如S基因的堿基序列設(shè)計(jì)引物

進(jìn)行PCR擴(kuò)增）若導(dǎo)入幼苗的基因編輯載體成功發(fā)揮作用，則基因被敲除，

靶區(qū)域的測(cè)序就會(huì)出現(xiàn)序列缺失，（或PCR無(wú)法擴(kuò)增出條帶）（5）不需要無(wú)菌操

作、不需要進(jìn)行植物組織培養(yǎng)、操作簡(jiǎn)便

解析（1）外植體經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織，愈傷組織經(jīng)過(guò)再分化形成幼苗，再分

化培養(yǎng)基需要有一定比例的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素,葉綠素的形成需要光，故再分

化過(guò)程中需要適宜的光照以誘導(dǎo)葉綠素的形成。⑵圖1中,若不經(jīng)過(guò)愈傷組織與

含重組載體的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)環(huán)節(jié)，直接誘導(dǎo)培養(yǎng)植株，則獲得的植株遺傳物質(zhì)全

部來(lái)自植株A,這種無(wú)性繁殖的方式可以保持植株A的遺傳特性。為遵守我國(guó)對(duì)

農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)行的標(biāo)識(shí)制度,需對(duì)含有外源基因的轉(zhuǎn)化植株A生產(chǎn)的種子的

包裝標(biāo)注“轉(zhuǎn)基因種子”。（3）見(jiàn)答案。（4）用含有重組載體的農(nóng)桿菌液處理植株

B后長(zhǎng)出的毛狀根中若含有基因編輯載體（陽(yáng)性毛狀根），則該基因編輯載體中的

綠色熒光蛋白基因可以在毛狀根中表達(dá)，故可通過(guò)觀(guān)察其是否含有綠色熒光篩選

陽(yáng)性毛狀根。若導(dǎo)入幼苗中的基因編輯載體成功發(fā)揮作用，則外S基因被敲除，

靶基因測(cè)序就會(huì)出現(xiàn)序列缺失,或用另一種方法，根據(jù)PDS基因的堿基序列設(shè)計(jì)

引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,不會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。（5）對(duì)比圖1與圖2知,與常規(guī)轉(zhuǎn)化法相

比,用CDB法進(jìn)行基因遞送不需要進(jìn)行植物組織培養(yǎng),不需要無(wú)菌操作,操作簡(jiǎn)便。

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3.某些植物根際促生菌具有生物固氮、分解淀粉和抑制病原菌等作用?；卮鹣铝?/p>

問(wèn)題：

⑴若從植物根際土壤中篩選分解淀粉的固氮細(xì)菌，培養(yǎng)基的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括

水和0

（2）現(xiàn)從植物根際土壤中篩選出一株解淀粉芽狗桿菌H,其產(chǎn)生的抗菌肽抑菌效

果見(jiàn)表。據(jù)表推測(cè)該抗菌肽對(duì)的抑制效果較好,若要確定

其有抑菌效果的最低濃度,需在1g-血丁濃度區(qū)間進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

抗菌肽濃度（Hg-mL）

測(cè)試菌

55.2027.6013.806.903.451.730.86

金黃色葡

一一———++

萄球菌

枯草芽

—————++

狗桿菌

禾谷鐮

—+++++4-

抱菌

假絲酵母一++++++

注：“十”表示長(zhǎng)菌，“-”表示未長(zhǎng)菌

（3）研究人員利用解淀粉芽抱桿菌H的淀粉酶編碼基因."構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒載體,

轉(zhuǎn)入大腸桿菌成功構(gòu)建基因工程菌Ao在利用A菌株發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶M過(guò)程中,

傳代多次后,生產(chǎn)條件未變，但某子代菌株不再產(chǎn)生淀粉酶Mo分析可能的原因是

（答出兩點(diǎn)即可）。

（4）研究人員通過(guò)肺上皮干細(xì)胞誘導(dǎo)生成肺類(lèi)器官，可自組裝或與成熟細(xì)胞組裝

成肺類(lèi)裝配體,如圖所示。肺類(lèi)裝配體培養(yǎng)需要滿(mǎn)足適宜的營(yíng)養(yǎng)、溫度、滲透壓、

pH以及（答出兩點(diǎn)）等基本條件。肺類(lèi)裝配體形成過(guò)

程中是否運(yùn)用了動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)?（填“是”或"否"）o

帥吁蛆焉胞

|一"兩標(biāo)正~|卜選

卷他加

勵(lì)類(lèi)制tTA附類(lèi)器仃BVV

|共乎.||共干界|

哪7」

肺坐找配體I肺生奘配體2

⑸耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是一種耐藥菌，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康?？蒲腥?/p>

員擬用MRSA感染肺類(lèi)裝配體建立感染模型,來(lái)探究解淀粉芽抱桿菌H抗菌肽是否

對(duì)MRSA引起的肺炎有治療潛力。以下實(shí)驗(yàn)材料中必備的是o

①金黃色葡萄球菌感染的肺類(lèi)裝配體

②MRSA感染的肺類(lèi)裝配體

③解淀粉芽抱桿菌H抗菌肽

④生理鹽水

⑤青霉素（抗金黃色葡萄球菌的藥物）

⑥萬(wàn)古霉素（抗MRSA的藥物）

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答案（1）淀粉、無(wú)機(jī)鹽（2）金黃色葡萄球菌和枯草芽泡桿菌1.73~3.45（3）

淀粉酶"基因發(fā)生突變或含有必基因的表達(dá)載體丟失（4）適宜的氣體和無(wú)菌、

無(wú)毒的環(huán)境否（5）②③④⑥

解析（1）培養(yǎng)基的成分一般包含水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，篩選分解

淀粉的固氮細(xì)菌所需要的選擇培養(yǎng)基中，除含水、無(wú)機(jī)鹽外,還應(yīng)含有淀粉,而不

能含有有機(jī)氮。⑵從表中數(shù)據(jù)可以看出，抗菌肽濃度為3.45~55.20ug-niL1

時(shí)，金黃色葡萄球菌和枯草芽抱桿菌均無(wú)法存活,禾谷鐮抱菌和假絲酵母在抗菌

肽濃度為55.20ug?ml?時(shí)無(wú)法存活，而在抗菌濃度低于27.6ug-ml?（含）時(shí)

可存活,故抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽布桿菌抑制效果較好。抗菌肽濃度

為1.73ug-ml/時(shí),金黃色葡萄球菌和枯草芽抱桿菌均能存活，而在3.45u

g-mL1時(shí)均不能存活，所以若要確定抗菌肽有抑菌效果的最低濃度，應(yīng)在

1.73~3.45ng?nd?濃度區(qū)間進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。（3）淀粉酶，"基因發(fā)生突變或含有"

基因的表達(dá)載體丟失時(shí)，菌株不能再產(chǎn)生淀粉酶M。（4）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)除需要滿(mǎn)足

適宜的營(yíng)養(yǎng)、溫度、滲透壓和pH條件外,還需要適宜的氣體環(huán)境（95%空氣和5%C02）

以滿(mǎn)足代謝需求和維持培養(yǎng)液pH,以及無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境防止其他微生物的污染

和細(xì)胞代謝物的危害。肺類(lèi)裝配體形成過(guò)程涉及兩種或多種細(xì)胞的共培養(yǎng)，但并

未運(yùn)用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)。（5）若要探究解淀粉芽抱桿菌H抗菌肽是否對(duì)MRSA

引起的肺炎有治療潛力，需至少取二組MRSA感染的肺類(lèi)裝配體進(jìn)行培養(yǎng),第一組

加入解淀粉芽胞桿菌H抗菌肽，第二組加入萬(wàn)古霉素（作為有抗菌效果的對(duì)照），

第三組加入等量生理鹽水（作為無(wú)抗菌效果的對(duì)照），觀(guān)察并比較三組肺類(lèi)裝配體

的生長(zhǎng)情況,若第一組肺類(lèi)裝配體生長(zhǎng)情況明顯好于第三組，且與第二組類(lèi)似或

好于第二組,說(shuō)明該抗菌肽對(duì)MRSA引起的肺炎有治療潛力。

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4.接種疫苗是預(yù)防傳染病的一項(xiàng)重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒

的傳播，降低乙型肝炎發(fā)病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要

成分是利用基因工程技術(shù)獲得的乙肝病毒表面抗原(一種病毒蛋白)?；卮鹣铝袉?wèn)

題。

(1)接種上述重組乙肝疫苗不會(huì)在人體中產(chǎn)生乙肝病毒，原因是—

⑵制備重組乙肝疫苗時(shí)，需要利用重組表達(dá)載體將乙肝病毒表面抗原基氤目的

基因)導(dǎo)入酵母細(xì)胞中表達(dá)。重組表達(dá)載體中通常含有抗生素抗性基因,抗生素抗

性基因的作用是■能識(shí)別載體中的啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)目

的基因轉(zhuǎn)衣的酶是

(3)目的基因?qū)虢湍讣?xì)胞后,若要檢測(cè)目的基因是否插入染色體中，需要從酵母

細(xì)胞中提取進(jìn)行DNA分子雜交,DNA分子雜交時(shí)應(yīng)使用的探針

是

⑷若要通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，請(qǐng)簡(jiǎn)要寫(xiě)出

實(shí)驗(yàn)思路。

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答案（1）該疫苗不含乙肝病毒DNA,不會(huì)在人體細(xì)胞內(nèi)增殖產(chǎn)生乙肝病毒（2）

作為標(biāo)記基因篩選出轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞RNA聚合酶（3）基因組DNA放射

性同位素等標(biāo)記的含有目的基因的DNA片段（4）從酵母細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，用

乙肝病毒表面抗原的特異性抗體進(jìn)行抗原一抗體雜交,若有雜交帶出現(xiàn)，說(shuō)羽酵

母細(xì)胞中表達(dá)出目的蛋白。

解析（1）只有乙肝病毒的DNA分子進(jìn)入人體細(xì)胞,才能以其為模板進(jìn)行DNA復(fù)制

和外殼蛋白的表達(dá),然后裝配形成子代乙肝病毒。重組乙肝疫苗只含有乙肝病毒

表面抗原，不含乙肝病毒DNA分子，不會(huì)在人休細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生乙肝病毒。（2）載休上

的抗生素抗性基因常作為標(biāo)記基因，用于將成功導(dǎo)入重組基因表達(dá)載體的細(xì)抱篩

選出來(lái)。細(xì)胞中的RNA聚合酶可識(shí)別載體中的啟動(dòng)子,并以目的基因的一條鏈為

模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。（3）由于不能確定目的基因是否插入染色體中，需提取酵母細(xì)胞的

基因組DNA,加熱變性，用基因探針進(jìn)行檢測(cè)。該探針中需要含有目的基因中的特

異性片段,且?guī)в蟹派湫酝凰氐葮?biāo)記。若受體細(xì)胞的染色體中含有目的基因，

該探針就會(huì)與目的基因通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合在一起,從而在放射性等檢測(cè)中觀(guān)

察到雜交帶。（4）抗乙肝病毒表面抗原的抗體可與乙肝病毒表面抗原特異性結(jié)合，

故可用該抗體與醛母細(xì)胞中提取出來(lái)的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原一抗體雜交，若出現(xiàn)雜交

帶，則可證明酵母細(xì)胞中表達(dá)出目的蛋白。

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5.GFP是水母體內(nèi)存在的能發(fā)綠色熒光的一種蛋白?？蒲腥藛T以湃基因?yàn)椴牧希?/p>

利用基因工程技術(shù)獲得了能發(fā)其他顏色熒光的蛋白，豐富了熒光蛋白的顏色種類(lèi)。

回答下列問(wèn)題。

（1）構(gòu)建突變基因文庫(kù)?？蒲腥藛T將G/?尸基因的不同突變基因分別插入載體,并轉(zhuǎn)

入大腸桿菌制備出G"基因的突變基因文庫(kù)。通常，基因文庠是

指O

（2）構(gòu)建目的基因表達(dá)載體?？蒲腥藛T從構(gòu)建的G”突變基因文庫(kù)中提取目的基

因（均為突變基因）構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如下所示（箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)

錄方向）。圖中①為;②為,其作用

是;圖中氨節(jié)青霉素抗性基因是一種標(biāo)記基因，其

作用是o

復(fù)制原點(diǎn)

⑶目的基因的表達(dá)。科研人員將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，

發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光,有的發(fā)黃色熒光,有的不發(fā)熒光。請(qǐng)從密碼子特點(diǎn)

的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是

（答出1點(diǎn)即可）。

（4）新蛋白與突變基因的關(guān)聯(lián)性分析。將上述發(fā)黃色熒光的大腸桿菌分離純化后，

對(duì)其所含的源突變基因進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)其堿基序列與西基因的不同,將該GFP

突變基因命名為J療基因（黃色熒光蛋白基因）。若要通過(guò)基因工程的方法探究

YFP基因能否在真核細(xì)胞中表iA,實(shí)驗(yàn)思路

是____________________________________________________________________

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答案⑴將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,

各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因（2）終止子啟動(dòng)子識(shí)別和結(jié)合

RNA聚合酶，驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)（3）密碼子的

簡(jiǎn)并性（4）獲取分基因并構(gòu)建表達(dá)載體,導(dǎo)入真核細(xì)胞，檢驗(yàn)其能否發(fā)出黃色

熒光

解析（1）見(jiàn)答案。（2）基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子和終止子分別位于目的基因的上

游和下游，由圖中677突變基因的轉(zhuǎn)錄方向可判斷，位于目的基因上游的②為啟

動(dòng)子,位于目的基因下游的①為終止子，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，

能驅(qū)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。氨節(jié)青霉素抗性基因?qū)儆跇?biāo)記基因，用于篩選含目的基用的

受體細(xì)胞。（3）絕大多數(shù)氨基酸都有幾個(gè)密碼子，若突變后的基因轉(zhuǎn)錄出的n）RNA

中的密碼子與原基因序列所對(duì)應(yīng)的密碼子編碼的氨基酸相同，則性狀不發(fā)生改變。

（4）若要通過(guò)基因工程的方法探究W基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，可用獲得的

勿孑基因構(gòu)建表達(dá)載體后導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，檢驗(yàn)受體細(xì)胞能否發(fā)出黃色熒光。

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6.賴(lài)氨酸是人體不能合成的必需氨基酸，而人類(lèi)主要食物中的賴(lài)氨酸含量很低，

利用生物技術(shù)可提高食物中賴(lài)氨酸含量。

回答下列問(wèn)題：

⑴植物細(xì)胞合成的賴(lài)氨酸達(dá)到一定濃度時(shí)，能抗制合成過(guò)程中兩種關(guān)鍵酶的活

性,導(dǎo)致賴(lài)氨酸含量維持在一定濃度水平,這種調(diào)節(jié)方式屬于o根據(jù)這

種調(diào)節(jié)方式,在培養(yǎng)基中添加,用于篩選

經(jīng)人工誘變的植物懸浮細(xì)胞，可得到抗賴(lài)氨酸類(lèi)似物的細(xì)胞突變體，通過(guò)培養(yǎng)獲

得再生植株。

⑵隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)與動(dòng)物細(xì)胞工程結(jié)合和發(fā)展,2011年我國(guó)首次利用轉(zhuǎn)基因和

體細(xì)胞核移植技術(shù)成功培育了高產(chǎn)賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)基因克隆奶牛。其基本流程為：

①構(gòu)建乳腺專(zhuān)一表達(dá)載體。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,為獲取富含賴(lài)氨酸的酪蛋白基

因(目的基因)，可通過(guò)檢索獲取其編碼序列,用化學(xué)合成法制備得到。

再將獲得的目的基因與含有乳腺特異性啟動(dòng)子的相應(yīng)載體連接,構(gòu)建出乳腺專(zhuān)一

表達(dá)載體。

②表達(dá)載體轉(zhuǎn)入牛胚胎成纖維細(xì)胞(BEF)。將表達(dá)載體包裹到磷脂等構(gòu)成的脂質(zhì)

體內(nèi)，與BEF膜發(fā)生,表達(dá)載體最終進(jìn)入細(xì)胞核,發(fā)生轉(zhuǎn)化。

③核移植。將轉(zhuǎn)基因的BEF作為核供體細(xì)胞,從牛卵巢獲取卵母細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)

及去核后作為o將兩種細(xì)胞進(jìn)行電融合，電融合的作用除了促進(jìn)細(xì)胞

融合,同時(shí)起到了重組細(xì)胞發(fā)育的作用。

④重組細(xì)胞的體外培養(yǎng)及胚胎移植。重組細(xì)胞體外培養(yǎng)至，植

入代孕母牛子宮角，直至小牛出生。

⑤檢測(cè)。DNA水平檢測(cè):利用PCR技術(shù)，以非轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞作為陰性對(duì)照，

以為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中存在目的基因。RNA水

平檢測(cè):從非轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因

牛耳組織細(xì)胞,提取總RNA,對(duì)總RNA進(jìn)行處理，以去除DNA污染,再經(jīng)逆

轉(zhuǎn)錄形成cDNA,并以此為，利用特定引物擴(kuò)增目的基因片段。結(jié)果

顯示目的基因在轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞內(nèi)表;而不在牛耳組織細(xì)胞內(nèi)表ii,

原因是什么?。

第n頁(yè)共49頁(yè)

答案（1）（負(fù)）反饋調(diào)節(jié)一定濃度的賴(lài)氨酸類(lèi)似物（2）①基因（序列）數(shù)據(jù)庫(kù)

②融合③受體細(xì)胞激活④桑共胚或囊胚⑤含酪蛋白基因的牛耳組織細(xì)

胞DNA酶PCR的模板構(gòu)建的表達(dá)載體只含有乳腺特異性啟動(dòng)子，只能在乳

腺細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,而在牛耳組織細(xì)胞中不能表達(dá)

解析（1）一個(gè)系統(tǒng)工作的效果反過(guò)來(lái)抑制該系統(tǒng)的工作稱(chēng)為負(fù)反饋調(diào)節(jié)，基于

此原理,若在培養(yǎng)基中加入一定濃度的賴(lài)氨酸類(lèi)似物作為選擇培養(yǎng)基，就可篩選

獲得抗賴(lài)氨酸類(lèi)似物的細(xì)胞突變體。（2）①用化學(xué)方法合成目的基因時(shí),需要已知

其全部序列,所以可以通過(guò)基因（序列）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索查詢(xún)?cè)撔蛄?。②利用膜融合?/p>

方式可將脂質(zhì)體包裹的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入特定受體細(xì)胞。③核移植時(shí)常用的受體細(xì)胞

為去核卵母細(xì)胞,攜帶轉(zhuǎn)基因的BEF（核供體細(xì)胞）與受體細(xì)胞通過(guò)電融合法誘導(dǎo)

融合，使供體核進(jìn)入卵母細(xì)胞,形成重組細(xì)胞，同時(shí)電刺激還可激活重組細(xì)胞，使

其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程。④當(dāng)重組細(xì)胞發(fā)育至桑直胚或囊胚時(shí)進(jìn)行胚胎移植。

⑤陽(yáng)性對(duì)照是指含有目的基因的細(xì)胞,所以用含酪蛋白基因的牛耳組織細(xì)胞作為

陽(yáng)性對(duì)照,通過(guò)對(duì)比判斷目的基因是否導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因牛組織細(xì)胞中?？蓮姆寝D(zhuǎn)基因

牛乳汁中的脫落細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因牛乳汁中的脫落細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因牛耳組織細(xì)胞中提取

總RNA,對(duì)總RNA進(jìn)行DNA酶處理，以除去細(xì)胞中的DNA,只剩下RNA,再通過(guò)逆轉(zhuǎn)

錄形成cDNA,并以此為模板利用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA檢驗(yàn)基因是否表達(dá)。不同種類(lèi)

細(xì)胞中遺傳信息的表達(dá)情況不同，含乳腺特異性啟動(dòng)子的表達(dá)載體只在乳腺細(xì)胞

中表達(dá)。

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7.種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對(duì)野生型擬南芥（2爐10）進(jìn)行誘變,

篩選到一株種子增大的突變體。通過(guò)遺傳分析和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)野生型〃/〃基因發(fā)生

?個(gè)堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測(cè)突變體的表型與其有

關(guān)，開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

回答下列問(wèn)題：

⑴擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DA1基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由

該突變?cè)斐?則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與植株的種子大小相近。

⑵用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DA1基因，用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物和

進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的加，基因可以正常表達(dá),其上

下游序列需具備o

⑶轉(zhuǎn)化后,T-DNA（其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換）可在基因組單一位點(diǎn)插

入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提

下,選出單一位點(diǎn)插入的植株,并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株（圖1）,用

于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。

仃----]農(nóng)桿肉（T-DMA攜帶。/W拈3和

I______）I；那待索抗性M因）

/花斤浸沒(méi)于農(nóng)桿1疝肉液進(jìn)行轉(zhuǎn)化

毛包_七0④_____匕仁晅_____毛

華區(qū)I；那瓊素選k那或家選仁那位東選上

T“代抒培齊姑篩杼培養(yǎng)站篩林培養(yǎng)站諦

選種子選種子選種子

I______________II______________III

T,代T,代T,代

圖1

①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T。代植株并自交，將「代種子播種在選擇培養(yǎng)基上,能夠萌發(fā)并生

長(zhǎng)的陽(yáng)性個(gè)體即表示其基因組中插入

To

②「代陽(yáng)性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基,選擇陽(yáng)性

率約/的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。

③將②中選出的丁2代陽(yáng)性植株。真“自交”“與野生型雜交”或“與

突變體雜交”）所得的T,代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽(yáng)性率達(dá)

到%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。

為便于在后續(xù)研究中檢測(cè)該突變,研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因

片段，再使用限制性核酸內(nèi)切酶X切割產(chǎn)物,通過(guò)核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測(cè),相

關(guān)信息見(jiàn)圖2,在電泳圖3中將酶切結(jié)果對(duì)應(yīng)位置的條帶涂黑。

皿小皿5'CCTTTTCATT.......E]AGGACTCT（；CCTT……TTACAAGTTA3'

rjrI-

3'GGAAAAGTAA........CTCCTGAC/VCGGAA.........AATCTTCAAT5'（150bpi

突變型5'CCTTTTCATT……EL^GGACTCTGCCTT……TTACAAGTTA3'

3'GGAAAAGTAA……TTCCTGAGACGGAA……AATGTTCAAT5,（150I2

1050........150（bp）

限制性?xún)?nèi)切酶XAAGG|NNNNNNCCTT

識(shí)別及切割序列TTCCNNN'NN'NIGGAA（N代表任意核甘酸）

圖2

標(biāo)準(zhǔn)參照物野生型突變型

150bp

100bp

（bp指核甘酸對(duì)）

50bp]

圖3

第13頁(yè)共49頁(yè)

答案（1）野生型（2）基因表達(dá)載體（或質(zhì)粒，或載體）啟動(dòng)子、終止子（3）

①T-DNA片段（或加/基因，或目的基因）②75③自交100

標(biāo)準(zhǔn)參照物野生型突變型

150bp!——?i=T

100bpijI>ii

（bp指核件酸對(duì);

(4)50bp??????

解析⑴野生型血/基因?yàn)轱@性基因，若導(dǎo)入成功，轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與

野生型的一致。（2）用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因需將目的基因插入Ti質(zhì)粒的

T-DNA中，所以需將二者用同種限制酶切割再用DNA連接酶連接。如要目的基因

正常表達(dá),其上游要有啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄開(kāi)始,下游要有終止子終止轉(zhuǎn)錄。（3）①能

在選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽(yáng)性個(gè)體說(shuō)明其基因組中成功插入含有DA1基因

的T-DNA片段。②代植株自交后所得的「代種子若能在選擇培養(yǎng)基上存活,則

為導(dǎo)入了力/基因和卡那霉素抗性基因的陽(yáng)性種子，但導(dǎo)入的數(shù)量未知，故用L

代植株繼續(xù)自交,若某“代植株為基因組單一位點(diǎn)插入,則其產(chǎn)生的七代種子在

選擇培養(yǎng)基上的存活率（陽(yáng)性率）為75%。③目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株應(yīng)為純合陽(yáng)性子代,T2

代植株中存在雜合陽(yáng)性和純合陽(yáng)性子代，應(yīng)該用自交的方法篩選，若后代不再出

現(xiàn)性狀分離，即陽(yáng)性率為100%,說(shuō)明培養(yǎng)基中的幼苗為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。（4）野生

型基因和突變型基因長(zhǎng)度均為150bp,野生型基因內(nèi)部無(wú)限制酶X的酶切位點(diǎn)，

突變型基因在50bp處有一個(gè)限制酶X的酶切位點(diǎn),所以酶切后野生型出現(xiàn)1個(gè)

150bp的條帶，而突變型出現(xiàn)100bp和50bp兩個(gè)條帶。

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8.研究者擬構(gòu)建高效篩選系統(tǒng),將改進(jìn)的苯丙氨酸合成關(guān)鍵酶基因P1導(dǎo)入谷氨

酸棒桿菌，以提高苯丙氨酸產(chǎn)量。

引物1

(1)如圖是該高效篩選系統(tǒng)載體的構(gòu)建過(guò)程。載體1中含有心N(卡那霉素抗性基

因)和SacZ?兩個(gè)標(biāo)記基因，為去除篩選效率較低的Sa的應(yīng)選擇引物

和,并在引物的(5'/3')端引入后”酶識(shí)別序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)

增,產(chǎn)物經(jīng)酶切、連接后環(huán)化成載體2。

(2)PCR擴(kuò)增載體3中篩選效率較高的標(biāo)記基因@s￡(鏈霉素敏感基因)時(shí)，引物應(yīng)

包含(比樂(lè)1/////7dW/Xho1)酶識(shí)別序列，產(chǎn)物經(jīng)單酶切后連接到載

體2構(gòu)建高效篩選載體4。

(3)將改進(jìn)的々基因整合到載體4構(gòu)建載體5。將載體5導(dǎo)入鏈霉素不敏感(由

外."突變?cè)斐?、卡那霉素敏感的受體菌。為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株，應(yīng)采

用含有的平板進(jìn)行初步篩選。

⑷用一定的方法篩選出如下菌株:以基因脫離載體5并整合到受體菌擬核DNA,

且載體5上其他DNA片段全部丟失。該菌的表型為o

A.卡那霉素不敏感、鏈霉素敏感

B.卡那霉素敏感、鏈霉素不敏感

0.卡那霉素和鏈霉素都敏感

D.卡那霉素和鏈霉素都不敏感

(5)可采用技術(shù)鑒定成功整合以基因的菌株。之后以發(fā)酵法檢測(cè)苯丙氨

酸產(chǎn)量。

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答案（1）14（以上兩空可調(diào)換）5'（2）Xho1⑶卡那霉素（4）B

（5）PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),答案合理即可）

解析⑴結(jié)合題圖中載體1分析,要去除Sa"區(qū)域,應(yīng)擴(kuò)增Sa”區(qū)域外的DNA

片段，所選擇的兩種引物應(yīng)方向相反,且位于擴(kuò)增部位兩端，故應(yīng)選引物1和4。

由于PCR擴(kuò)增時(shí),子鏈從引物的3'端開(kāi)始延伸，因此應(yīng)在引物的5'端引入合適的

限制酶識(shí)別序列N2）根據(jù)題圖中構(gòu)建栽體4的過(guò)程可知，從載體3擴(kuò)增出的RpsL

片段插入了載體2的XhoI位點(diǎn)，故以載體3為模板擴(kuò)增RpsL時(shí)所需引物應(yīng)包含

防。1酶識(shí)別序列。（3）因受體菌的表型為鏈霉素不敏感、卡那霉素敏感，載體5

上具有的$￡（鏈霉素敏感基因）和后〃艮（卡那霉素抗性基因），故成功導(dǎo)入載體5的

菌株鏈霉素敏感、卡那霉素不敏感,所以,為獲得成功導(dǎo)入載體5的菌株,應(yīng)利用

含有卡那霉素的平板正行初步篩選，選擇平板上出現(xiàn)的菌落即可。（4）川基因整

合到受體菌擬核DNA,且載體5上其他DNA片段全部丟失,所以該菌的表型依然是

受體菌的表型，即鏈霉素不敏感、卡那霉素敏感,故B正確。（5）以受體菌擬核DNA

為模板,采用以基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,若獲得相應(yīng)大小片段,即可表明該

菌株成功整合了々基因。

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9.纖毛是廣泛存在的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，功能異?？梢l(fā)多種疾病。因此,研究纖毛形成￡勺作

用機(jī)制具有重要意義。

⑴纖毛結(jié)構(gòu)如圖I所示,由細(xì)胞膜延伸形成的纖毛膜主要由組成。基體由

中心體轉(zhuǎn)變而來(lái)，中心體在有絲分裂中的功能是,

⑵某病人腎小管上皮細(xì)胞纖毛異常，為了分析纖毛相關(guān)基因X是否發(fā)生了變異,對(duì)基因X

進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物測(cè)序。從細(xì)胞樣品中分離DNA時(shí),可通過(guò)交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與

核蛋白結(jié)合的DNA分離出來(lái)，溶液中添加NaCl至2.0mol/L的目的

是。PCR擴(kuò)增時(shí)，需在催化下，在引物的端進(jìn)

行DNA鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測(cè)序。

⑶為研究蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白

具有綠色熒光，可指示其在細(xì)胞內(nèi)位置。將X-GFP基因融合片段M導(dǎo)入如圖II所示載體

質(zhì)粒Y,構(gòu)建Y-M重組質(zhì)粒（在EcoRV位點(diǎn)插入片段）。請(qǐng)完成下表。

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限制酶識(shí)別序列

RamH1G1GATCC

EcoBVGATIATC

HitMAlAGCTI'

Bgl11AIGATCT

第Y-M連接處測(cè)序后部分序列

QI5'…ACATCTCCCATATT…3'

Q25'…AGATCTCCAAGCTT…3'

Q35r???AAGCTTCCGGATCC-3,

Q45'…AACCTTCCCATATC…3'

圖HI

分步實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)簡(jiǎn)易操作、結(jié)果、分析

PCR鑒定正向

①選擇圖II引物_________；②PCR目的產(chǎn)物約為_(kāi)_____bp

重組質(zhì)粒Y-M

確保M及連接

③質(zhì)粒測(cè)序，圖in中正確的是（選填序利編號(hào)）

處序列正確

檢測(cè)融合蛋白④對(duì)照質(zhì)粒Y-GFP（僅表達(dá)GFP）與實(shí)臉質(zhì)粒Y-M分別導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組整個(gè)

細(xì)胞均有綠色熒光而實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部，說(shuō)明

⑷為研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化,采用熒光定量PCR法檢測(cè)健康人與病人基

因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA,經(jīng)形成CDNA作為模板,PCR擴(kuò)增結(jié)

果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Q值為15,而病人Ct值為20（0值是產(chǎn)

物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù)）。從理論上估算，在PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)

物中,健康人樣品的R的產(chǎn)物大約是病人的一倍。

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答案⑴脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)出星射線(xiàn)，形成紡錘體⑵溶解DNAThqDNA聚合酶（或

耐高溫的DNA聚合酶）3'（3）①a、b②1100③Q4④蛋白X定位于纖毛基部（4）

逆轉(zhuǎn)錄32

解析（1）纖毛膜由細(xì)胞膜延伸形成,細(xì)胞膜的組成成分主要是脂質(zhì)和蛋白質(zhì);在低等植物

和動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂的前期，中心體發(fā)出星射線(xiàn)，形成紡錘體。（2）DNA在2.0mol/L的

NaCI溶液中溶解度很高,常用該濃度的NaCl溶液溶解DNAoPCR是體外大量擴(kuò)增DNA

分子的技術(shù),PCR過(guò)程需要TaqDNA聚合酶（或耐高溫的DNA聚合酶，可催化DNA子鏈

的延伸）、引物（在PCR過(guò)程中為T(mén)aqDNA聚合酶提供使該酶能夠從引物的3,端

開(kāi)始連接脫氧核昔酸）、四種游離的脫氧核昔酸（合成DNA子鏈的原料）、緩沖液（提供液

體環(huán)境及離子條件）、DNA母鏈（DNA復(fù)制的模板）。（3）片段M正向拼接和反向拼接結(jié)

果如圖：

L300.二|L800hp.弓?物卜

痛a引物|）匕8001甲一

用PCR鑒定是否為正向重組質(zhì)粒Y-M,可選用引物a和引物b,目的產(chǎn)物約為1100bp。

若M與載體質(zhì)粒Y正確連接，則上游連接處含有HindIH+EcoRV的識(shí)別序列，即

51.AAGCTT…GATATC.3,即Q4,下游含有EcoRV+8amHI的識(shí)別序列，即

5，…GATATC…GGATCC..3,即質(zhì)粒測(cè)序正確的是Q4。本實(shí)驗(yàn)的目的是借助綠色熒光蛋

白檢測(cè)蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的位置，則實(shí)驗(yàn)組導(dǎo)入的是質(zhì)粒Y-M（M為X-GFQ基因融合片

段），表達(dá)X-GFP,對(duì)照組導(dǎo)入僅表達(dá)GFP的質(zhì)粒Y-GFP,依據(jù)實(shí)驗(yàn)組綠色熒光集中在纖毛

基部，而對(duì)照組整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光，可知蛋白X定位于纖毛基部。（4）提取細(xì)胞的總

RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,cDNA作為熒光定量PCR的模板。熒光定量PCR過(guò)程中,特

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定PCR循環(huán)次數(shù)下產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與模板量呈正相關(guān),雖然限定了總cDNA模板量

相等，但要注意由于健康人和病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平不同,相應(yīng)的mRNA含量不同,因此基

因Z的cDNA含量并不相同，設(shè)健康人基因Z的cDNA模板量為x,病人的為乂由“健康人

。值為15,而病人。值為20”知,xx2is=yx220,PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中,健康人樣品的

目的產(chǎn)物大約是病人的（戶(hù)22。）+822。）=222。）+62號(hào)=25=32倍。

知識(shí)拓展在基因工程中常用綠色熒光蛋白基因作為標(biāo)記基因或報(bào)告基因，用以檢測(cè)目

的基因是否完成表達(dá)，同時(shí)也可以檢測(cè)目的蛋白在細(xì)胞中的分布及含量。

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10用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人類(lèi)需要的生物產(chǎn)品。

在此過(guò)程中需要使用多種工具酶,其中4種限制性核酸內(nèi)切菊的切割位點(diǎn)如圖所示。

GAATH:CCCCCCCTGCACGATATC

CTTAACccccccCACCTCCl'ATAG

限制酶:EeoWISma1EcoRV

回答下列問(wèn)題:

(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和RDNA連接酶。上圖中酶切

割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中酶以

割后的DNA片段可以用T.DNA連接酶連接。

(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是o

(3)DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征。如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以

保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能;質(zhì)粒DNA分子上有,便于

外源DNA插入;質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選

出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞,方法

是o

(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子,啟動(dòng)子是

指__________________________________________________________________________

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答案（DEcoRI、PstIEcoR【、SmaI、PstI、EcoRV（2）磷酸二酯鍵（3）自我

復(fù)制限制能切割位點(diǎn)將待篩選的宿主細(xì)胞接種到含該抗生素的培養(yǎng)基中，能夠生長(zhǎng)

的是含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞（4）RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA片段

解析（1）E.coliDXA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端連接起來(lái)。/DNA連接

酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，乂可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末

端。（2）DNA連接酶是通過(guò)催化兩個(gè)核俘酸之間形成磷酸二酯鍵,將雙鏈DNA片段“縫合”

起來(lái)的。（3）作為載體,質(zhì)粒DNA分子上必須有復(fù)制原點(diǎn),才能使質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能進(jìn)

行自我復(fù)制;且質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，便于外源DNA插入；

質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因，可以用添加特定抗生素的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的宿

主細(xì)胞，以達(dá)到篩選目的，（4）啟動(dòng)子是指RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA片段。

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11.PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測(cè)。為檢測(cè)病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進(jìn)行了

相關(guān)操作:①分析PCR擴(kuò)增結(jié)果;②從病人組織樣本中提取D\A;③利用PCR擴(kuò)增DNA片段;

④采集病人組織樣本?；卮鹣铝袉?wèn)即：

(1)若要得到正確的檢測(cè)結(jié)果，正確的操作順序應(yīng)該是(用數(shù)字序號(hào)表

示)。

(2)操作③中使用的酶是。PCR反應(yīng)中的每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、_

三步，其中復(fù)性的結(jié)果是—

(3)為了做出正確的診斷:PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與特異性結(jié)合。

(4)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)是指o該

技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷等方面。

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答案（1）④②③①（2）DNA聚合前延伸引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈DNA結(jié)合

（3）病原菌DNA（4）在生物體外大量快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)

解析（1）根據(jù)題干中給出的信息分析，若要檢測(cè)病人是否感染了某種病原菌，需要從病

人體內(nèi)獲取組織樣本,提取樣本中的DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)胤再分析PCR擴(kuò)增的結(jié)果。由此可

知若要得到正確的檢測(cè)結(jié)果,正確的操作順序應(yīng)該是④②③①。（2）操作③利用PCR擴(kuò)增

DNA片段時(shí)需要使用的的是（耐高溫的）DNA聚合酣，即TaqD"聚合酶。PCR反應(yīng)中的每

次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步，其中復(fù)性是指溫度下降到55飛0°C,兩種引物通過(guò)

堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單銖DNA結(jié)合。（3）為了做出正確的診斷，應(yīng)檢測(cè)病原菌的遺傳物質(zhì)，

所以PCR反應(yīng)所用的引物應(yīng)該能與病原菌DNA特異性結(jié)合。（4）PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技

術(shù)是指在生物體外大量快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù),它能以極少量的DNA為模板,在兒

小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。

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12.人類(lèi)y基因啟動(dòng)子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A

蛋臼后，丫基因的表達(dá)被抑制。通過(guò)改變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對(duì)Y基因表達(dá)的抑制，

可對(duì)某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療。科研人員擴(kuò)增rY基因上游不同長(zhǎng)度的片段,將

這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測(cè)，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體

位置。相關(guān)信息如圖所示。

然曹部終止子熒光蛋白基因P

Nh；lIM-II心I"終定子

(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需在引物末端添加限制酶

識(shí)別序列。據(jù)圖可知,在F1~F7末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是,在R末端添

加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是o本實(shí)驗(yàn)中，從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)

程共需要種酶。

(2)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞,成功轉(zhuǎn)化后,含F(xiàn)PF6與R擴(kuò)增產(chǎn)物

的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光,含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光。含F(xiàn)7與

R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無(wú)熒光的原因

是O

(3)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,含F(xiàn)CF4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光,而含

F5'F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若Y基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對(duì)應(yīng)

的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列,據(jù)此結(jié)果可推測(cè),BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位

于,理由是o

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答案（l）SalIEcoRI6（2）F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動(dòng)子，熒光蛋白基因不

表達(dá)（3）引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上根據(jù)有無(wú)熒光情況判

斷,F1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均有結(jié)合位點(diǎn)，因此結(jié)合位點(diǎn)位于F4所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的下游

（右側(cè)）；F5?F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物上均無(wú)結(jié)合位點(diǎn),可知結(jié)合位點(diǎn)位于F5所對(duì)應(yīng)調(diào)控序列的上

游（左側(cè)），所以結(jié)合位點(diǎn)位于引物F4與F5在調(diào)控序列上所對(duì)應(yīng)序列之間的區(qū)段上

解析（1）觀(guān)察圖示可知:熒光蛋白基因的左側(cè)為終止子,為了將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向涌入

載體指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá),擴(kuò)增后的產(chǎn)物的插入點(diǎn)應(yīng)在熒光蛋白基因的右側(cè),而熒光

蛋白基因的右側(cè)有三個(gè)限制酶切割位點(diǎn),分別是MunI、EcoRI和XhoI的切割位點(diǎn),但

因?yàn)橛肊coRI會(huì)破壞熒光蛋白基因，所以只能用MunI和Xho【切割載體,切割后載體的

部分序列如圖所示：

熒光蛋白基因?|

TGCTCGAG

GTTAACGAGCTC

tt

MunIIXM?

I川肉神限制IW切知

熒光或白基四

AATTGCTCGAG

GTTAAC\GAGCTC-

此片段要被轉(zhuǎn)換為插入

進(jìn)來(lái)的擴(kuò)增國(guó)的產(chǎn)物

擴(kuò)增后的產(chǎn)物的兩端添加限制前后得到的DNA片段能夠替換上圖載體中位于MunI和

XhoI限制隨切割位點(diǎn)之間的片段,并能與左側(cè)的熒光蛋白基因片段及右側(cè)的片段連接

起來(lái)。由題圖中終止子及基因的位置可知，F(xiàn)1~F7末端添加序列后應(yīng)與XhoI切割的末端

相連,R末端添加序列后應(yīng)與MunI切割的末端相連。由于調(diào)控序列及啟動(dòng)子中有XhoI

限制酶切割位點(diǎn)，所以需尋找切割后的末端能與XhoI限制酶切割后的末端連接且調(diào)控

序列及啟動(dòng)子中無(wú)其切割位點(diǎn)的限制酶,SalI符合這一要求，所以在F1~F7末端添加的

序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是SalI;由于調(diào)控序列及啟動(dòng)子中含有MunI的切割位點(diǎn),所以需

尋找切割后的末端能與MunI限制酶切割后的末端連接且調(diào)控序列及啟動(dòng)子中無(wú)其切割

位點(diǎn)的限制酶,EcoRI符合這一要求,所以在R末端添加的序列所對(duì)應(yīng)的限制酶是EcoR

I。擴(kuò)增后的產(chǎn)物的兩端添加的限制醐識(shí)別序列如圖所示：

GAATTCGTCGAC

CTTAACCACCTC

I

EcoRISalI

用網(wǎng)種限制IW切割

AATTCTCGAC

CTTAA、CACCT

擴(kuò)增產(chǎn)物

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本實(shí)驗(yàn)中，用EcoRI和Sal【切割擴(kuò)增產(chǎn)物,用MunI和XhoI切割載體,故從產(chǎn)物擴(kuò)增到

載體構(gòu)建完成的整個(gè)過(guò)程需要Taq酶、SalI、EcoRI、XhoI、MunI、DNA連接酶共6

種酶。（2）將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞,成功轉(zhuǎn)化后，含F(xiàn)CF6與R擴(kuò)

增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白，受體細(xì)胞有熒光，說(shuō)明F1~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物含完整的啟動(dòng)子,

熒光蛋白基因表達(dá)；