醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：凝集反應(yīng)

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)：凝集反應(yīng)內(nèi)容：四、直接凝集反應(yīng)玻片凝集反應(yīng)—細(xì)菌的鑒定、ABO血型鑒定試管凝集反應(yīng)五、間接凝集反應(yīng)正向間接凝集反應(yīng)—間接凝集乳膠試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)反向間接凝集反應(yīng)—反向間接血凝試驗(yàn)、協(xié)同凝集試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn)試驗(yàn)、直接凝集反應(yīng)（Directagglutinationreaction）細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下直接與相應(yīng)的抗體結(jié)合形成肉眼可見(jiàn)的凝集塊，稱(chēng)為直接凝集反應(yīng)。常用的直接凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種。㈠玻片凝集反應(yīng)（Slideagglutinationtest）玻片凝集反應(yīng)是將已知的抗體直接與未知的顆粒性抗原物質(zhì)（如細(xì)菌，紅細(xì)胞等）在玻片上混合，在有適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)存在的條件下，如兩者對(duì)應(yīng)便發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見(jiàn)凝集物，即為陽(yáng)性；如兩者不對(duì)應(yīng)，便無(wú)凝集物出現(xiàn)，即為陰性。此法屬定性試驗(yàn)，主要用于細(xì)菌鑒定和分型、人類(lèi)紅細(xì)胞ABO血型的鑒定等。細(xì)菌的鑒定：【材料】⑴1∶20稀釋的傷寒桿菌的診斷血清。⑵傷寒桿菌、大腸桿菌18~24小時(shí)培養(yǎng)物、生理鹽水。⑶潔凈載玻片、接種環(huán)、酒精燈、記號(hào)筆等?！痉椒ā竣湃崈糨d玻片一張，用記號(hào)筆劃分為三格，并依次編號(hào)為1、2、3。⑵用滅菌的接種環(huán)取生理鹽水于玻片的三格內(nèi)，各加2~3環(huán)。⑶將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌，冷卻后自平皿挑取少量大腸桿菌置于第2格生理鹽水中混勻。然后，同法分別取少許傷寒桿菌于第1格及第3格，與生理鹽水混勻。⑷用滅菌接種環(huán)于第2格加傷寒桿菌診斷血清2~3環(huán)并混勻，同法取傷寒桿菌診斷血清2~3環(huán)，加于第1格中混勻。⑸輕搖玻片，靜置1~2分鐘后，觀察結(jié)果，【結(jié)果】如上述混合懸液由均勻混濁狀變?yōu)槌吻逋该?，并出現(xiàn)大小不等的乳白色凝集塊者為陽(yáng)性；如混合物仍呈均勻混濁，無(wú)凝集物者為陰性。【注意事項(xiàng)】⑴每一待檢菌均須作生理鹽水對(duì)照，如對(duì)照凝集則表示細(xì)菌發(fā)生自凝，試驗(yàn)無(wú)效。⑵取細(xì)菌培養(yǎng)物時(shí)，不宜過(guò)多。與診斷血清或生理鹽水混合時(shí)，必須將細(xì)菌涂散，涂均勻，但不宜涂得太寬，以免很快干涸而影響結(jié)果。⑶傷寒桿菌為腸道致病菌，在實(shí)驗(yàn)中務(wù)必嚴(yán)格無(wú)菌操作，遵守實(shí)驗(yàn)規(guī)則，用后的載玻片應(yīng)立即放入盛有消毒劑的容器內(nèi)。⒉ABO血型鑒定【材料】⑴抗A標(biāo)準(zhǔn)血清、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清。⑵載玻片、采血針、碘酒和酒精棉球、牙簽、生理鹽水、毛細(xì)吸管等?！痉椒ā竣湃崈糨d玻片一張，用記號(hào)筆分為兩格，于上角分別注明A、B字樣。⑵用毛細(xì)吸管取生理鹽水于玻片的兩格內(nèi)各加一滴。⑶用碘酒酒精棉球消毒耳垂或手指尖，采血1~2滴混入玻片上的生理鹽水中，迅速用牙簽混勻，制成血球懸液。⑷在兩格血球懸液中分別加抗A標(biāo)準(zhǔn)血清和抗B標(biāo)準(zhǔn)血清一滴，分別用牙簽兩端攪拌混勻，2~5分鐘后搖晃玻片，觀察結(jié)果。？【結(jié)果】混合液由均勻紅色混濁狀逐漸變?yōu)橥该?，并出現(xiàn)大小不等的紅色凝集塊者即為紅細(xì)胞凝集；若混合液仍呈均勻混濁狀，無(wú)凝集塊，則表明紅細(xì)胞未發(fā)生凝集。血型鑒定試驗(yàn)結(jié)果及鑒定見(jiàn)表表血型鑒定試驗(yàn)結(jié)果判定診斷血清血型抗A抗BA＋－B－＋AB＋＋O－－“＋”表示凝集“－”表示不凝集【注意事項(xiàng)】⑴試驗(yàn)用載玻片要清潔，并務(wù)必注明A和B字樣。⑵待檢紅細(xì)胞懸液不宜過(guò)稀或過(guò)濃。⑶要及時(shí)觀察結(jié)果，以防時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使標(biāo)本干涸而影響結(jié)果的觀察和判定。㈡試管凝集試驗(yàn)本試驗(yàn)是用已知的顆粒性抗原來(lái)檢測(cè)未知的抗體及其相對(duì)含量，此法屬定量試驗(yàn)。方法是用生理鹽水將待測(cè)血清在試管中進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋?zhuān)缓笥诟鞴苤屑尤氲攘康囊阎乖瓚乙?，?jīng)過(guò)一定時(shí)間后，觀察有無(wú)凝集并根據(jù)凝集程度判定血清抗體的效價(jià)?！静牧稀竣眰畻U菌H菌液。⒉傷寒桿菌免疫血清（1∶10稀釋?zhuān)?。⒊生理鹽水、小試管、試管架、1ml和5ml刻度吸管等?！痉椒ā竣比崈粜≡嚬?支列于試管架上，依次編號(hào)。⒉用5ml吸管吸取生理鹽水，每管內(nèi)加入0.5ml。⒊用1ml吸管吸取待檢血清0.5ml加入第1管，吹吸3次，充分混勻后，吸出0.5ml加入第2管，如上依次稀釋至第7管，自第7管吸出0.5ml棄去。第8管不加血清作為對(duì)照管。見(jiàn)圖4．用5ml吸管吸取傷寒桿菌菌液，從第8管起向前加，每管加入0.5ml。5．搖勻后，置室溫或37℃24小時(shí)后，觀察結(jié)果。操作程序見(jiàn)表表試管凝集試驗(yàn)操作程序（單位：ml）12345678生理鹽水0.50.50.50.50.50.50.50.51∶10傷寒桿菌免疫血清0.50.50.50.50.50.50.5棄去0.5傷寒桿菌H菌液0.50.50.50.50.50.50.50.5血清最終稀釋度1∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶12801∶2560對(duì)照管室溫或37℃，24h結(jié)果【結(jié)果】⒈凝集強(qiáng)弱，以下列記號(hào)表示：＋＋＋＋：管內(nèi)液體澄清，細(xì)菌全部凝集于管底，輕搖有大片凝集塊。＋＋＋：管內(nèi)液體輕度混濁，細(xì)菌大部分凝集于管底，凝集塊較小。＋＋：管內(nèi)液體中度混濁，細(xì)菌部分凝集于管底，凝集塊更細(xì)小。＋：管內(nèi)液體中度混濁，僅少量細(xì)菌凝集。－：液體混濁，無(wú)凝集。若放置較長(zhǎng)時(shí)間觀察結(jié)果，未凝集的，細(xì)菌亦可沉積于管底。與凝集塊沉淀物不同：前者是個(gè)小圓點(diǎn)，邊緣光滑整齊，而后者似傘狀，鋪開(kāi)沉淀于管底，邊緣不整齊。⒉首先觀察第8管（對(duì)照管）。正確結(jié)果應(yīng)是管底沉淀物為圓形，邊緣整齊，輕輕振搖，細(xì)菌分散呈均勻混濁。若出現(xiàn)了非特異的凝集，則本試驗(yàn)無(wú)效。⒊試驗(yàn)管應(yīng)由第1管看起。H菌液凝集物呈疏松棉絮狀，沉于管底，輕搖時(shí)易離散和升起。⒋凝集效價(jià)的判定：與相應(yīng)菌液發(fā)生中等程度（＋＋）凝集的血清最高稀釋度為該被檢血清的凝集效價(jià)，用稀釋倍數(shù)表示之。如第1管仍無(wú)凝集現(xiàn)象，應(yīng)報(bào)“＜1∶40”，如第7管仍是“＋＋”或更強(qiáng)凝集，應(yīng)報(bào)“＞1∶2560”。【注意事項(xiàng)】⒈抗原、抗體在比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)。如果抗體的濃度過(guò)高，則無(wú)凝集物形成，此為前帶現(xiàn)象，需要在測(cè)定結(jié)果時(shí)加以鑒別。⒉判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)在暗背景下通過(guò)強(qiáng)光檢查。⒊注意溫度、PH、電解質(zhì)、振搖對(duì)本試驗(yàn)的影響。⒋觀察結(jié)果時(shí)，最好不要振搖試管，以免將凝集物搖散而影響他人觀察。試驗(yàn)、間接凝集反應(yīng)（Indirectagglutination）間接凝集是將可溶性抗原（或抗體）吸附或偶聯(lián)在一種與免疫無(wú)關(guān)的載體顆粒表面，使其成為致敏載體，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，在電解質(zhì)存在的條件下，發(fā)生凝集。根據(jù)載體致敏時(shí)所用制劑及反應(yīng)方式，間接凝集反應(yīng)有以下幾種方法：㈠正向間接凝集反應(yīng)將已知可溶性的抗原吸附在載體顆粒表面，與相應(yīng)的抗體結(jié)合所發(fā)生的凝集稱(chēng)正向間接凝集反應(yīng)，見(jiàn)圖。用于檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗體，如細(xì)菌、病毒、螺旋體等以及某些自身抗體（抗核抗體、抗腎抗體、抗甲狀腺抗體等）?？捎米鬏d體的物質(zhì)有乳膠顆粒、紅細(xì)胞（人O型紅細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞、家兔紅細(xì)胞等）、聚苯乙烯、活性炭及硅酸鋁顆粒等。若所用載體為乳膠顆粒，則稱(chēng)間接乳膠凝集試驗(yàn)，若載體為紅細(xì)胞，稱(chēng)為間接血凝試驗(yàn)。下面分別以?xún)烧邽槔M(jìn)行介紹。圖正相間接凝集反應(yīng)原理示意圖⒈間接乳膠凝集試驗(yàn)（Indirectlatexagglutinationtest）（玻片法）——檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕因子類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，患者可產(chǎn)生自身抗體，即類(lèi)風(fēng)濕因子（一種抗變性IgG的抗體，多為IgM類(lèi)抗體）。檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕因子可輔助診斷此病?！静牧稀竣糯龣z血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清。⑵類(lèi)風(fēng)濕乳膠診斷試劑（吸附有變性IgG的乳膠顆粒。將IgG經(jīng)63℃10分鐘處理，可獲得變性的IgG）。⑶載玻片、毛細(xì)滴管等。【方法】⑴取潔凈載玻片一張，用標(biāo)記筆劃分為3格，用毛細(xì)滴管分別向3格內(nèi)加1滴待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清。⑵再分別向3格內(nèi)加致敏乳膠1滴，用牙簽充分混勻后，搖動(dòng)玻片2~3分鐘后，觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】以肉眼觀察出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性，不出現(xiàn)凝集為陰性。玻片法為定性測(cè)定，也可以用試管法作定量測(cè)定?！咀⒁馐马?xiàng)】⑴試劑應(yīng)保存在4℃，切勿凍存。使用前應(yīng)使試劑接近室溫并搖勻。⑵日光燈光線(xiàn)不利于觀察結(jié)果。⒉間接血凝試驗(yàn)(Indirecthemagglutinationtest)將可溶性抗原（細(xì)菌的提取液）吸附于紅細(xì)胞，成為抗原致敏的紅細(xì)胞，這種致敏紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體作用可產(chǎn)生凝集現(xiàn)象?！静牧稀竣盼⒘垦澹篤型孔底，8×12孔⑵稀釋棒：一種特制的小鋁棒，下接一不銹鋼頭，中間有米形小縫，吸取量為25ul。⑶抗原致敏的紅細(xì)胞懸液、稀釋液等。【方法】⑴用微量加樣器吸取稀釋液，在微量血凝板小孔內(nèi)各加25ul，每份標(biāo)本做兩排，一排為測(cè)定孔，一排為對(duì)照孔。一般將受檢血清倍比稀釋至1∶64，每塊血凝板可同時(shí)檢測(cè)8份標(biāo)本。⑵用稀釋棒2支蘸取受檢血清后，分別加入測(cè)定排和對(duì)照排的第1孔，雙手搓轉(zhuǎn)稀釋棒，使孔內(nèi)血清和稀釋液充分混勻，然后將稀釋棒移至第2孔，依同法按順序作對(duì)倍稀釋。⑶測(cè)定排各加稀釋液1滴，對(duì)照排各孔加抑制用抗原1滴，放微型振蕩器上振蕩1~2分鐘，蓋上一塊玻璃板，放37℃保溫1小時(shí)。⑷各孔加0.5%抗原致敏的紅細(xì)胞懸液1滴，放微型振蕩器上振蕩1分鐘，移至室溫1~2小時(shí)，觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】凡紅細(xì)胞沉積于孔底，集中呈一小圓點(diǎn)的為不凝集。如紅細(xì)胞凝集，則分布于孔底周?chē)?。根?jù)紅細(xì)胞凝集程度強(qiáng)弱，可分為以下4級(jí)：＋＋＋＋：紅細(xì)胞形成片層凝集，均勻布滿(mǎn)孔底或凝集邊緣皺縮如花邊狀。＋＋＋：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積略小于＋＋＋＋。＋＋：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積較小，邊緣較松散。＋：紅細(xì)胞沉積于孔底，周?chē)猩⒃诘纳倭磕?。－：紅細(xì)胞沉積于孔底，呈小圓盤(pán)點(diǎn)狀，邊緣清晰整齊。陰性標(biāo)本表現(xiàn)為兩排均不凝集。當(dāng)兩排紅細(xì)胞孔數(shù)相等時(shí)，則為非特異性的凝集?！咀⒁馐马?xiàng)】⑴使用器材必須清潔，特別是血凝板要按規(guī)定處理，否則對(duì)結(jié)果影響大。⑵受檢血清要新鮮。⑶測(cè)定一批標(biāo)本時(shí)，要同時(shí)作已知陽(yáng)性、陰性以及不加受檢血清的空白對(duì)照。㈡反向間接凝集反應(yīng)用特異性抗體致敏（或吸附于）載體顆粒，用于檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原。見(jiàn)圖⒈反向間接血凝試驗(yàn)(Reversedindirecthemagglutinationtest)是用已知的抗體致敏紅細(xì)胞，檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗原。以檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）?！静牧稀竣?∶20抗-HBs致敏紅細(xì)胞、純化的1∶20抗-HBs、待檢血清、稀釋液。⑵“V”型微量血凝板，25ul稀釋棒、微量攪拌器、刻度吸管、滴管（40滴/ml）【方法】⑴配制致敏血球懸液：于每瓶?jī)龈稍\斷血球加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻血球懸液，濃度約為0.6%。⑵正式試驗(yàn)，加樣程序見(jiàn)表①在“V”型微量血凝板上，每份待檢血清設(shè)立8孔，于各孔內(nèi)用40滴/ml滴管各加1滴稀釋液（相當(dāng)于25ul/0.025ml）。②用25ul容量的稀釋棒蘸滿(mǎn)待檢血清分別依在各孔內(nèi)，捻轉(zhuǎn)作對(duì)倍稀釋?zhuān)ㄒ话忝靠變?nèi)均需捻轉(zhuǎn)10次左右），直至第7孔，第8孔為致敏血球?qū)φ?，另設(shè)第9孔為陽(yáng)性對(duì)照，加25ulHBsAg陽(yáng)性血清。③于每孔加入25ul混勻的致敏血球懸液。④將血凝板置于微型振蕩器上振蕩1~2分鐘，置37℃1小時(shí)后觀察結(jié)果：表反向間接血凝試驗(yàn)加樣程序（單位：ul）123456789稀釋液2525252525252525—待檢血清25252525252525棄去2525陽(yáng)性血清致敏血球252525252525252525血清稀釋度1∶41∶81∶161∶321∶641∶1281∶256血球陽(yáng)性對(duì)照對(duì)照37℃，1h結(jié)果不凝集：紅細(xì)胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點(diǎn)。明顯凝集（++）紅細(xì)胞于孔底形成薄膜狀凝集，中央可見(jiàn)疏松的紅點(diǎn)。出現(xiàn)明顯凝集（++）的血清最高稀釋度為HBsAg效價(jià)，凡效價(jià)≥1∶16者需進(jìn)一步做中和試驗(yàn)。⑶中和試驗(yàn)：在血凝板上每份標(biāo)本設(shè)測(cè)定排和對(duì)照排，每排8孔，于每孔加稀釋液25ul,用2支稀釋蘸被檢血清，分別在兩排作對(duì)倍稀釋至第7孔，第8孔不含血清，為血球?qū)φ?。然后，于測(cè)定排各孔加稀釋液25ul，對(duì)照排各孔加1∶20抗-HBs25ul。血凝板振蕩1~2分鐘后，置37℃30分鐘，取出，于各孔加25ul致敏血球振搖混勻，置37℃1小時(shí)后觀察結(jié)果。凡正式試驗(yàn)效價(jià)≥1∶16，且中和試驗(yàn)的對(duì)照排凝集孔數(shù)至少低于測(cè)定排凝集孔數(shù)2孔，為HBsAg陽(yáng)性，否則系非特異性凝集?！咀⒁馐马?xiàng)】⑴配置的致敏血球懸液一般在當(dāng)天用完，若置2~10℃使用期不超過(guò)3天。⑵試驗(yàn)用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。⑶血凝板、稀釋棒用后均需用次氯酸鈉（10%v/v）浸泡過(guò)夜；滴管需煮沸10分鐘，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。⒉協(xié)同凝集試驗(yàn)（Coagglutinationtest）金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上有一種成分，稱(chēng)為葡萄球菌A蛋白（StaphylococcusproteinA，SPA）。SPA能與人及各種哺乳動(dòng)物（如豬、兔、豚鼠等）血清中的IgG類(lèi)抗體的Fc端結(jié)合，成為致敏的載體顆粒。與SPA結(jié)合后的IgG的Fab端可與相應(yīng)的抗原結(jié)合，出現(xiàn)凝集反應(yīng)，稱(chēng)為協(xié)同凝集試驗(yàn)。實(shí)際上協(xié)同凝集試驗(yàn)也是將已知抗體結(jié)合在載體顆粒（葡萄球菌）上，用于檢測(cè)未知抗原，故亦屬反向間接凝集反應(yīng)?！静牧稀竣沤瘘S色葡萄球菌CowanⅠ株、含0.5%福爾馬林的pH7.40.01mol/lPBS、無(wú)菌生理鹽水。⑵傷寒沙門(mén)氏菌可溶性O(shè)抗原溶液、傷寒沙門(mén)氏菌O抗原免疫血清。⑶載玻片、毛細(xì)吸管、接種環(huán)等?！痉椒ā竣臩PA菌穩(wěn)定液的制備：①取CowanⅠ菌株接種在肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，再轉(zhuǎn)接于普通平板37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。②用PBS洗下菌苔，以3000r/min離心15min，洗滌3次，然后用含0.5%福爾馬林的pH7.40.01mol/lPBS稀釋成10%菌懸液，分裝保存。⑵SPA菌診斷液的制備：取上述10%SPA菌穩(wěn)定液1ml，加傷寒沙門(mén)氏菌免疫血清混勻，置37℃30分鐘，每隔10分鐘振蕩一次，以3000r/min離心15min，棄上清液，并用PBS洗滌兩次，最后加PBS至10ml。⑶取一潔凈玻片分成3格，依次編號(hào)。①于第1、2格分別加入一滴（約50ul）SPA菌診斷液，第3格加入一滴（約50ul）金黃色葡萄球菌液（未致敏SPA菌液）②于第1、3格分別加入一滴（約50ul）傷寒沙門(mén)氏菌O抗原溶液，第2格加入一滴生理鹽水。③分別用牙簽混勻，1~2分鐘內(nèi)觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】正確結(jié)果應(yīng)是：第1格內(nèi)金黃色葡萄球菌凝集成清晰可見(jiàn)的顆粒，液體澄清透明為陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果；第2、3格為對(duì)照，無(wú)凝集。表SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)加樣程序123SPA菌診斷液SPA菌診斷液未致敏SPA菌液傷寒O抗原生理鹽水傷寒O抗原混勻后放置2分鐘＋－