《化妝品眼刺激性-雞胚絨毛尿囊膜血管試驗》

ICS71.100.70

CCSY42

GDCA

廣東省化妝品學會團體標準

T/GDCA010—2022

化妝品眼刺激性-雞胚絨毛尿囊膜血管試驗

Cosmeticseyeirritation-ChorioallantoicMembraneVascularAssay

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

廣東省化妝品學會??發(fā)布

T/GDCA010—2022

化妝品眼刺激性-雞胚絨毛尿囊膜血管試驗

1范圍

本文件規(guī)定了雞胚絨毛尿囊膜血管試驗的基本原理、試驗準備、試驗方法、評判標準及結果分析。

本文件適用于化妝品、化妝品原料刺激性的評估。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T17999.1SPF雞微生物學監(jiān)測第1部分：SPF雞微生物學監(jiān)測總則

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

眼刺激性eyeirritation

眼前部直接接觸受試物后引起的眼及其周圍粘膜可逆性炎性變化。

絨毛尿囊膜chorioallantoicmembrane,CAM

胚齡4d～5d時，由絨毛膜體壁中胚層和尿囊膜臟層中胚層融合而成，其組織學結構有三層。

鬼影血管ghostvessel

血管內無血液灌注的血管現(xiàn)象。

充血hypermia

血管內血液不流動或血液充盈所致的血管膨脹現(xiàn)象。

出血Hemorrhage

血液從血管內流出血管外，可以表現(xiàn)為血管外出現(xiàn)點狀出血或絮狀的彌漫性出血等多種形式。

無特定病原體SpecificpathogenFree,SPF

一般指無傳染病、無特定的微生物和寄生蟲存在。

4基本原理

絨毛尿囊膜（CAM）上豐富的血管網(wǎng)絡很好地模擬了眼結膜結構，因此，基于CAM的體外測試是眼刺

激使用最早和最廣泛的替代方法之一。本試驗利用孵化第10天胚齡受精雞胚絨毛尿囊膜血管系統(tǒng)完整、

明顯和透明的特點，將一定量受試物直接與絨毛尿囊膜接觸，作用一段時間之后觀察絨毛尿囊膜血管損

傷（如鬼影血管、毛細血管充血、不同程度的出血），對不同的血管損傷程度進行評分，血管損傷越嚴

重分值越大，刺激性越嚴重。本試驗特別強調CAM的血管效應，如由此引發(fā)的鬼影血管、毛細血管充血、

不同程度的出血等現(xiàn)象。

5試驗準備

1

T/GDCA010—2022

雞胚

5.1.1品系和來源

應當選用SPF雞胚，推薦選用白萊杭雞（WhiteLeghornchicken）受精雞胚，也可選用其它品系雞

胚，供應商應具有農(nóng)業(yè)部門認可的《獸藥生產(chǎn)、檢驗用SPF雞(蛋)定點生產(chǎn)企業(yè)》資格，雞胚質量應符

合相關標準的要求，如GB/T17999.1。

5.1.2運輸和貯存

購買7天胚齡以內的雞胚，應在不影響胚胎活性或發(fā)育的情況下轉移或運輸雞胚，盡量避免對雞胚

搖動、不必要的傾斜、敲打以及其它機械性刺激。

未放置于孵化箱培養(yǎng)0天胚齡的雞胚宜置于13℃-22℃條件中存放，為減少貯存時間對種蛋質量的影

響，一般不宜超過7天。

5.1.3孵化條件

孵化溫度37.5℃±0.5℃，相對濕度55%-70%，轉盤頻率1次/小時-6次/小時。0天胚齡的雞胚孵化前

應使用含有濃度為0.1%苯扎溴銨溶液或其它不影響雞胚生長發(fā)育的消毒劑進行清潔并消毒表面。

5.1.4試驗雞胚挑選

試驗前，將待檢測雞胚取出，置于黑暗處，用照蛋器檢查胚胎情況，若有豐富、規(guī)律的血管，則雞

胚存活，若血管稀少且無一定規(guī)律或無血管生長，則雞胚沒有孵化成活或沒有受精，棄之。

設備儀器和試劑

5.2.1試驗所需儀器設備如下：

——恒溫恒濕培養(yǎng)箱；

——自動孵化箱；

——LED高亮度冷光源照蛋器；

——解剖器具：醫(yī)用鋸齒鑷刀或尖頭鑷；

——聚四氟乙烯樹脂環(huán)：12*9*1.5mm；

——移液槍及一次性適配吸頭；

——電子計時器；

——玻璃器皿：錐形瓶、小燒杯；

——保鮮膜；

——小噴壺。

5.2.2試驗所需試劑如下：

本文件所用試劑和水，除非另有規(guī)定，應使用分析純試劑和應符合GB/T6682-三級水的規(guī)定。

——氯化鈉；

——丙烯酰胺；

——無菌水。

受試物及制備

5.3.1原料

應根據(jù)常用添加量或建議添加量選一個或多個濃度用溶劑制備成澄清的溶液。水溶性原料可采用無

菌水作為溶劑，油溶性原料可采用橄欖油或其它不引起血管損傷的物質作為溶劑。

5.3.2化妝品成品或半成品

化妝品半成品及成品應以原液未稀釋的形式進行測試；面膜成品應將料體擠至無菌的錐形瓶中再進

行測試。

對照物及制備

5.4.1陰性對照

2

T/GDCA010—2022

通常選用質量濃度為0.9％的氯化鈉溶液，用于陰性對照。每次受試物測試，均應設置0.9％氯化鈉

溶液的陰性對照，確保試驗條件不會導致刺激性反應出現(xiàn)。

5.4.2陽性對照

每次試驗都應設立一個陽性對照，如果檢測試驗只是用于鑒定嚴重刺激性物質，則陽性對照物應當

是一種在CAMVA中能產(chǎn)生嚴重反應的物質，如10%丙烯酰胺。一般來說，10%丙烯酰胺通常表現(xiàn)為中度刺

激性。亦可選用其他具有中度刺激性物質作為陽性對照。

5.4.3溶劑對照

如果受試物用橄欖油進行稀釋，那么試驗應設置橄欖油為溶劑對照。如果使用除無菌水或橄欖油以

外的其他溶劑或載體，則選擇這種溶劑或載體作為對照物質。

預試驗

5.5.1預試驗目的及必要性

確定受試物是否適合用本方法試驗，確定受試物的血管情況是否能夠用該評價方法進行評價。（可

參考表1）。

5.5.2預試驗條件

需要對受試樣品進行預試驗，一般針對顏色較為特殊或可能具有染色功能的原料、半成品及成品或

受試樣品的狀態(tài)為粉狀等特殊樣品需要進行預試驗。

5.5.3預試驗過程

預試驗用3枚雞胚，取約40μL（μg）受試物均勻覆蓋在受試環(huán)內的CAM表面，受試物作用30分鐘后，

觀察血管反應情況，記錄觀察結果。

5.5.4受試物局限性

如果預試驗結果表明血管損傷情況不屬于標準評價（見表1）范圍內及受試物的物理特性，既不能

用液體添加法（見6.3）也不能用固體添加法（見6.4）進行試驗，則正式試驗不必進行。

這些情況包括：

——血管效應不屬于標準評價范圍；

——對血管具有藥理作用的血管活性物質；

——對CAM具有不可逆染色作用的染料；

——對CAM具有粘附作用且不可沖冼的粘性物質。

6試驗方法

試驗分組

每個受試樣品應采用10枚雞胚進行測試，每批次雞胚應設陰性對照、陽性對照，各不小于3枚，必

要時應設立溶劑對照。

CAM制備

取出一個10天胚齡的雞胚，用照蛋器照看氣室，確定氣室位置，用手捻鉆手動打孔工具在氣室上開

一個小窗口，用醫(yī)用眼科彎尖頭鑷子剝去氣室上層的蛋殼部分，暴露白色的卵殼膜，吸管滴加適量0.9%

氯化鈉溶液使卵殼膜濕潤，待完全濕潤后將0.9%氯化鈉溶液傾出。小心用鑷子去除卵殼膜，去除過程中

要謹慎，保證血管膜不受損，去除卵殼膜后露出豐富毛細血管的則是CAM。

液體添加法

6.3.1添加受試樣

3

T/GDCA010—2022

將聚四氟乙烯樹脂環(huán)置于CAM上，作為受試區(qū)域，用移液槍移取40μL的待測樣品至聚四氟乙烯樹脂

環(huán)內，記錄加樣品的時間,用無菌水打濕保鮮膜后并將打濕面的保鮮膜蓋在氣室上，把雞胚移至恒溫恒

濕箱內培養(yǎng)30分鐘。

6.3.2結果觀察

取出受試雞胚，根據(jù)血管損傷程度評分（標準可參考表1）。必要時可設備對反應前后的絨毛尿囊

膜情況進行拍照記錄，并通過過反應前后的照片比對，對CAM的損傷情況及程度進行分析。

固體添加法

6.4.1添加受試物

將聚四氟乙烯樹脂環(huán)置于雞胚的絨毛尿囊膜上，作為受試區(qū)域，用藥勺或活塞式移液器取適量的待

測樣品約40μg，即均勻鋪平至聚四氟乙烯樹脂環(huán)內。記錄加樣時間用無菌水打濕保鮮膜后并將打濕面的

保鮮膜蓋在氣室上，把雞胚移至恒溫恒濕箱內培養(yǎng)30分鐘。

6.4.2結果觀察

取出受試雞胚，根據(jù)血管損傷程度評分。若受試物影響結果的觀察，則在觀察前需用0.9%生理鹽水

輕輕沖洗受試區(qū)域內待測物質，直至可清晰觀察到CAM的情況為止，沖洗次數(shù)盡可能保持在3次以內。取

出雞胚后應立即觀察環(huán)內的血管損傷情況并進行評分（標準可參考表1）。必要時可用設備對反應前后

的CAM情況進行拍照記錄，并通過反應前后的照片比對，對CAM的損傷情況及程度進行分析及評價。

表1評分標準

血管效應評分現(xiàn)象描述

無反應0觀察不到反應，CAM正常。

鬼影血管1血管內無血流，血管清晰。

毛細血管損傷2充血，即CAM毛細血管或小血管的管血流增加。

極輕微出血3環(huán)內有細小出血點（1-10個）。

輕微出血4環(huán)內有細小出血點＞10個或小出血點不可數(shù)且覆蓋環(huán)內區(qū)域不足1/8。

極輕度出血5環(huán)內出血點覆蓋面積1/8－1/4。

輕度出血6環(huán)內出血點覆蓋面積1/4－1/2。

中度出血7環(huán)內大量出血點或小區(qū)域出血范圍達到1/2－3/4。

嚴重出血8環(huán)內出血點區(qū)域＞3/4。

7結果分析

每枚雞蛋的結果應進行評價及記分，最終將得出的10個分值去除最高分和最低分，剩余8個有效分

值，根據(jù)應用式（1）計算刺激分（Normalconcentrationirritationscore，NC）。

····················································(1)

?1+?2+…+??

式中：??=?

X——刺激評分；

n——去除最高分和最低分后有效雞胚個數(shù)。

根據(jù)計算的NC數(shù)值按表2受試物刺激性進行分類。

4

T/GDCA010—2022

表2刺激性評價

分值表現(xiàn)備注

0<NC≦2無刺激無損傷性刺激，此時毛細血管未有出血損傷。

2<NC≦3輕微刺激輕微損傷性刺激，此時毛細血管出現(xiàn)輕微性出血損傷。

3<NC≦5中度刺激較為嚴重的損傷性刺激，此時毛細血管出現(xiàn)較為嚴重的出血損傷。

NC＞5嚴重刺激極為嚴重的損傷性刺激，此時毛細血管大面積出血，且出血量較大。

8廢棄物處置

試驗用雞胚應用高濃度消毒劑消毒處置后，按一般的廢棄物進行處理。具有刺激性、丙烯酰胺等廢

液按危險廢物處理。

9檢測結果報告

試驗報告應包含以下內容：

——受試物信息：名稱、批次、樣品性狀及特性；

——受試物測試雞胚個數(shù)、有效雞胚個數(shù)、分值及結果評價。

5

T/GDCA010—2022

A

A

附錄A

（資料性）

測試結果中血管效應

測試結果中血管效應代表性圖見表A.1。

表A.1測試結果中血管效應代表性圖

無反應鬼影血管

毛細血管損傷極輕微出血

輕微出血極輕度出血

輕度出血中度出血

6

T/GDCA010—2022

嚴重出血