《口蹄疫、非洲豬瘟、豬瘟、豬繁殖與呼 吸綜合征病毒抗體聯(lián)檢膠體金免疫層析 檢測方法》

ICSXX.XXX

XXX

團體標準

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口蹄疫、非洲豬瘟、豬瘟、豬繁殖與呼

吸綜合征病毒抗體聯(lián)檢膠體金免疫層析

檢測方法

ColloidalGoldimmunochromatographicStripfordetectionofFMDVtypeO、

ASFV、CSFV、PRRSV

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布

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口蹄疫、非洲豬瘟、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體聯(lián)檢膠體

金免疫層析檢測方法

1范圍

本文件規(guī)定了口蹄疫、非洲豬瘟、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體聯(lián)檢膠體金免疫層析檢測方

法的原理、儀器設備及耗材、操作步驟、結果判定。

本文件適用于快速檢測豬血清中口蹄疫病毒O型抗體、非洲豬瘟病毒抗體、豬瘟病毒抗體、豬繁殖

與呼吸綜合征病毒抗體。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范

GB/19489樣品處理的生物安全措施、實驗室生物安全通用要求

NYT541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范

GB/19489-2008生物安全實驗要求

中華人民共和國農業(yè)部公告第302號獸醫(yī)實驗室生物安全管理規(guī)范

中華人民共和國主席令第五十六號《中華人民共和國生物安全法》

中華人民共和國主席令第八十七號《中華人民共和國動物防疫法》

中華人民共和國國務院令第424號《病原微生物實驗室生物安全管理條例》

3術語和定義

膠體金顆粒：goldnanoparticles

膠體金免疫層析技術：ColloidalGoldimmunochromatographyAssay（GICA）

是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種免疫標記技術。

4符號和縮略語

下列符號適用于本文件。

下列縮略語適用于本文件。

BSA：牛血清白蛋白。

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IgG：免疫球蛋白G。

PB：磷酸鹽緩沖液。

pH：pH值。

5.1試劑

5.1.1口蹄疫O型病毒純化抗原146S。具體制備方法如下：（1）毒種的繁殖與滅活：將

O/MYA98/JSCJ/2010細胞毒種，按維持液5%～10%的量接種生長良好的BHK-21單層細胞轉瓶內，于

37℃培養(yǎng)8～12個小時，當達到90%以上細胞病變時，用7.5%NaHCO3溶液調pH值至7.6～7.8，加

入青霉素（100IU/mL）、鏈霉素（100IU/mL），病毒液用2mmol/L二乙烯亞胺在30℃下滅活24h，

加入2%硫代硫酸鈉阻斷，4000r/min、2-8℃離心30min，取上清（O/MYA98/JSCJ/2010滅活制苗病

毒抗原液），-20℃凍存。（2）抗原的去脂與濃縮：①-20℃保存的O/MYA98/JSCJ/2010滅活制苗病

毒抗原液10000mL按80g/L加入PEG6000和40g/L加入NaCl，充分攪拌4h，2-8℃過夜；②將步

驟（1）得到的病毒液8000r/min離心45min，棄上清；③PB緩沖液（0.2mol/LNa2HPO4,0.2mol/L

NaH2PO4，pH7.4）懸浮步驟②獲得的沉淀（冰上操作），勻漿器反復研磨，至終體積100mL；④向

步驟③獲得的溶液中加入2倍體積的三氯乙烯于密閉容器中，劇烈振蕩充分乳化，然后2～8℃、8000

r/min離心30分鐘，收集上層液；⑤將步驟④獲得的上層液2～8℃、45000r/min離心180分鐘，棄

上清；⑥PB緩沖液懸浮沉淀，勻漿器中研磨，至終體積6mL；⑦向步驟⑥獲得的溶液中加入1%的

脫氧膽酸鈉溶液，充分搖勻，2～8℃過夜，即為濃縮病毒抗原。（3）蔗糖密度梯度離心：配制50%蔗

糖母液；用50%蔗糖配制45%、35%、25%、15%四種濃度梯度蔗糖溶液；蔗糖梯度制備及離心，離心

管中先加入45%蔗糖溶液2.5mL，依次疊加35%、25%、15%蔗糖溶液2.5mL，制備6個蔗糖梯度柱，

2～8℃靜止平衡過夜；次日將濃縮病毒抗原液6mL分別加入6個蔗糖梯度柱頂部（每個柱子加入1mL），

2-8℃、35000r/min離心150min。（4）抗原146S收集：離心結束后，取1管上述梯度離心純化抗原，

自上而下吸取梯度離心抗原，每0.5mL作為1個收集級分，對收集的級分進行順序編號，共收集22個

級分。其余5支離心管重復上述操作，并分別將同層收集級分合并至22個級分管中。用紫外分光光度

計（北京普析）測定22個級分OD259nm值，按照FMDV完整病毒粒子146S可能存在的區(qū)域分析數(shù)

值，當?shù)?5-19號收集級分出現(xiàn)明顯吸收峰值，取該區(qū)域OD259nm大于0.4的級分合并，作為口蹄疫

O型病毒純化抗原146S。

5.1.2非洲豬瘟病毒重組p30蛋白。制備方法如下：以GenBank數(shù)據(jù)庫中非洲豬瘟病毒基因II型Georgia

2008/1株p30基因序列（Genebank號：MH910495）為表達目的基因的參考序列，利用基因合成的方法

由金斯瑞生物科技股份有限公司合成p30基因序列，并將其導入pGEMT-easy載體中，構建帶有p30

基因的重組質粒pGEM-p30。利用限制性內切酶EcoRI與NotI對保存的重組質粒pGEM-p30進行雙酶

切，回收p30基因目的片段，16℃過夜連接同樣雙酶切后回收的pET-28a載體。后轉化DH5α感受態(tài)細

胞，篩選陽性菌株，提取陽性質粒。將該質粒經EcoRI與NotI雙酶切驗證，結果出現(xiàn)明顯兩條帶且目

的片段大小約為585bp，符合預期；PCR擴增（T7通用引物對T7P：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；

T7T：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’）出大小約為884bp基因片段，符合預期，將酶切和PCR鑒

定一致的質粒進行測序鑒定，測序結果顯示與非洲豬瘟病毒（ASFV）基因II型Georgia2008/1株的p30

基因序列的同源性為100%，并將測序正確的質粒命名為pET-28a-p30重組陽性質粒。將pET-28a-p30

重組陽性質粒轉化至Rosetta感受態(tài)細胞中。挑取單克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測

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序。將測序正確的菌液1：100加入到2×YT培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)至OD600nm為3.0左右后，加入終濃度為

0.1mmol/L的IPTG在37℃誘導表達4h，12000r/min離心10min后收集沉淀，PBS重懸沉淀后置-80℃

冷凍，然后融化，反復凍融3次，超聲破碎至液體清亮（超聲條件：電壓200V，工作3s，暫停3s）；

12000r/min離心10min，分別收集沉淀和上清，SDS分析蛋白的表達情況。將沉淀使用8mol/L

的尿素裂解后經3mol/L鹽酸胍復性，使用Ni柱法進行純化。純化方法為：分別用終濃度為20mmol/L

和50mmol/L的咪唑洗脫雜蛋白3次，每次10mL，然后使用200mmol/L的咪唑洗脫目的蛋白。

5.1.3口蹄疫、非洲豬瘟、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體聯(lián)檢膠體金免疫層析試紙條，按照附

錄A.1制備。

5.1.4相關試劑配制按照附錄B.1配制。

6儀器設備及耗材

6.1三維劃膜噴金儀

6.2數(shù)控高速斬切機

6.3隔水式恒溫培養(yǎng)箱

6.4磁力攪拌器

6.5硝酸纖維素膜

6.6玻璃纖維紙

6.7吸水紙

6.8PVC背襯板

6.9試紙卡殼

6.10微量可調移液器（10μL、50μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格）

7技術原理

本聯(lián)檢試紙卡采用膠體金免疫層析方法和直接法試驗原理，檢測口蹄疫病毒、非洲豬瘟病毒、豬瘟

病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒四種病毒病抗體。通過樣本與免疫膠體金標記物沿層析膜移動，樣本中

口蹄疫病毒、非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒四種病毒病抗體分別與四種免疫膠體

金標記物、檢測線（T線）上的抗原結合而顯色，免疫膠體金標記物繼續(xù)移動與質控線（C線）上的抗

體結合顯色。若某病毒對應的觀測窗里的質控線與檢測線均顯色，則該待測樣本含有該病毒抗體；若某

病毒對應的觀測窗里的質控線顯色且檢測線不顯色，則該待測樣本不含有該病毒抗體。

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8樣品采集及保存

樣品采集按照NY/T541進行。無菌注射器靜脈采血，不少于2mL，用自然析出法分離血清后，置

于無菌血清管中，若在一周內檢測，可置2℃~8℃條件下保存，若超過一周檢測，應置于-20℃以下

冷凍保存。

血清樣本運輸時應注意2-8℃冷藏。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術管理規(guī)范》進行樣品的生物安

全標識。

9樣品檢測

將聯(lián)檢試紙卡從2～8℃取出，平衡到室溫（25℃左右），拆除試紙卡外包鋁箔袋，將卡平放在桌面

上。用移液器吸取血清樣本，分別向樣品孔中各加入30μL，之后再分別向樣品孔中各滴加30μL擴展液。

10min內，結果將會出現(xiàn)在觀測框內。實驗結束后，將使用過的試紙條、移液器吸頭與被檢樣品應作無

害化處理。

10試驗成立條件

試紙條質控線顯色，試驗成立，結果有效；試紙條質控線不顯色，試驗不成立，結果無效。

11結果判定（參考附錄A）

觀察各個觀測窗內檢測線色帶有無，按照附圖2和如下原則分別進行判定。判定標準如下：被檢

血清樣品質控線與檢測線都出現(xiàn)清晰可見紅色條帶，判定為陽性；被檢血清樣品僅質控線出現(xiàn)清晰

可見紅色條帶，檢測線不顯色，判定為陰性。

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附錄A

(規(guī)范性)

A.1口蹄疫O型病毒抗體膠體金免疫試紙條的制備

A.1.1膠體金溶液制備：取1%氯金酸水溶液1mL加99mL蒸餾水制成0.01％氯金酸水溶液，加熱至沸

騰，加入不同1.5mL質量百分比濃度為1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸，直至液體變?yōu)榫萍t色，冷卻

備用。

A.1.2.免疫膠體金（1）的制備：用0.02MK2CO3溶液調節(jié)pH值至7.5，按1.1μg/mL最佳標記量加入

口蹄疫O型病毒純化抗原146S，磁力攪拌40min，加入100g/LBSA至終濃度為10g/L，磁力攪拌30min。

10000r/min離心40min，棄上清，將沉淀用金膠緩沖液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗

糖，5%BSA)懸浮溶解，備用。

免疫膠體金（2）的制備：用0.02MK2CO3溶液調節(jié)pH值至8.5，按4μg/mL最佳標記量加入兔抗

IgG，磁力攪拌40min，加入100g/LBSA至終濃度為10g/L，磁力攪拌30min。10000r/min離心40min，

棄上清，將沉淀用金膠緩沖液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗糖，5%BSA)懸浮溶解。將

免疫膠體金（1）與（2）以固定比例混合，涂覆玻璃纖維膜。

A.1.3上述口蹄疫O型病毒免疫膠體金溶液噴涂到長270mm、寬10mm的玻璃纖維墊(Ahlstrom公司)

上，37℃下干燥0.5h，得到免疫膠體金探針墊。

A.1.4含有質控線（C線）和檢測線（T線）的硝酸纖維素膜的制備：將口蹄疫O型病毒純化抗原146S

調整至0.2mg/mL，羊抗兔抗體調整至0.2mg/mL的工作濃度，分別噴涂于硝酸纖維素膜上，形成檢測

帶與質控帶，37℃干燥0.5h，保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.5.試紙的組裝：在底襯，一般采用PVC材料，上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆有免疫膠體金

的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙，按照要求切割成3.98mm寬度的試紙，即制成口蹄疫O型

病毒抗體膠體金免疫層析試紙。

A.2非洲豬瘟病毒抗體膠體金免疫試紙條的制備

A.2.1膠體金溶液制備：取1%氯金酸水溶液1mL加99mL蒸餾水制成0.01％氯金酸水溶液，加熱至沸

騰，加入不同1.5mL質量百分比濃度為1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸，直至液體變?yōu)榫萍t色，冷卻

備用。

A.2.2免疫膠體金（1）的制備：用0.02MK2CO3溶液調節(jié)pH值至9.0，按2.7μg/mL最佳標記量加入

非洲豬瘟病毒重組p30蛋白，磁力攪拌40min，加入100g/LBSA至終濃度為10g/L，磁力攪拌30min。

10000r/min離心40min，棄上清，將沉淀用金膠緩沖液(pH7.5含10mMPB,0.25%Tween-20,10%蔗糖,

5%BSA)懸浮溶解，備用。

免疫膠體金（2）的制備：用0.02MK2CO3溶液調節(jié)pH值至8.5，按4μg/mL最佳標記量加入兔抗

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IgG，磁力攪拌40min，加入100g/LBSA至終濃度為10g/L，磁力攪拌30min。10000r/min離心40min，

棄上清，將沉淀用金膠緩沖液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗糖，5%BSA)懸浮溶解。將

免疫膠體金（1）與（2）以固定比例混合，涂覆玻璃纖維膜。

A.2.3上述非洲豬瘟病毒免疫膠體金溶液噴涂到長270mm、寬10mm的玻璃纖維墊(Ahlstrom公司)上，

37℃下干燥0.5h，得到免疫膠體金探針墊。

A.2.4含有質控線（C線）和檢測線（T線）的硝酸纖維素膜的制備：將非洲豬瘟病毒重組p30蛋白調

整至0.1mg/mL，羊抗兔抗體調整至0.2mg/mL的工作濃度，分別噴涂于硝酸纖維素膜上，形成檢測帶

與質控帶，37℃干燥0.5h，保存?zhèn)溆谩?/p>

A.2.5試紙的組裝：在底襯1（一般采用PVC材料）上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆有免疫膠體金

的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙，按照要求切割成3.98mm寬度的試紙，即制成非洲豬瘟病

毒抗體膠體金免疫層析試紙。

A.3豬瘟病毒抗體膠體金免疫試紙條的制備

A.3.1膠體金溶液制備：取1%氯金酸水溶液1mL加99mL蒸餾水制成0.01％氯金酸水溶液，加熱至沸

騰，加入不同1.5mL質量百分比濃度為1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸，直至液體變?yōu)榫萍t色，冷卻

備用。

A.3.2免疫膠體金（1）的制備：用0.02MK2CO3溶液調節(jié)pH值至7.5，按34μg/mL最佳標記量加入豬

瘟病毒重組E2蛋白，磁力攪拌40min，加入100g/LBSA至終濃度為10g/L，磁力攪拌30min。10000r/min

離心40min，棄上清，將沉淀用金膠緩沖液(pH7.5含10mMPB,0.25%Tween-20,10%蔗糖,5%BSA)懸

浮溶解，備用。

免疫膠體金（2）的制備：用0.02MK2CO3溶液調節(jié)pH值至8.5，按4μg/mL最佳標記量加入兔抗

IgG，磁力攪拌40min，加入100g/LBSA至終濃度為10g/L，磁力攪拌30min。10000r/min離心40min，

棄上清，將沉淀用金膠緩沖液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗糖，5%BSA)懸浮溶解。將

免疫膠體金（1）與（2）以固定比例混合，涂覆玻璃纖維膜。

A.3.3上述豬瘟病毒免疫膠體金溶液噴涂到長270mm、寬10mm的玻璃纖維墊(Ahlstrom公司)上，37℃

下干燥0.5h，得到免疫膠體金探針墊。

A.3.4含有質控線（C線）和檢測線（T線）的硝酸纖維素膜的制備：將豬瘟病毒重組E2蛋白調整至

0.57mg/mL，羊抗兔抗體調整至0.2mg/mL的工作濃度，分別噴涂于硝酸纖維素膜上，形成檢測帶與質

控帶，37℃干燥0.5h，保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3.5試紙的組裝：在底襯（一般采用PVC材料）上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆有免疫膠體金

的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙，按照要求切割成3.98mm寬度的試紙，即制成豬瘟病毒抗

體膠體金免疫層析試紙。

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A.4豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體膠體金免疫試紙條的制備

A.4.1膠體金溶液制備：取1%氯金酸水溶液1mL加99mL蒸餾水制成0.01％氯金酸水溶液，加熱至沸

騰，加入不同1.5mL質量百分比濃度為1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)煮沸，直至液體變?yōu)榫萍t色，冷卻

備用。

A.4.2免疫膠體金（1）的制備：用0.02MK2CO3溶液調節(jié)pH值至7.5，按4μg/mL最佳標記量加入豬

繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白，磁力攪拌40min，加入100g/LBSA至終濃度為10g/L，磁力攪拌30min。

10000r/min離心40min，棄上清，將沉淀用金膠緩沖液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗

糖，5%BSA)懸浮溶解，備用。

免疫膠體金（2）的制備：用0.02MK2CO3溶液調節(jié)pH值至8.5，按4μg/mL最佳標記量加入兔抗

IgG，磁力攪拌40min，加入100g/LBSA至終濃度為10g/L，磁力攪拌30min。10000r/min離心40min，

棄上清，將沉淀用金膠緩沖液(pH7.5含10mMPB，0.25%Tween-20，10%蔗糖，5%BSA)懸浮溶解。將

免疫膠體金（1）與（2）以固定比例混合，涂覆玻璃纖維膜。

A.4.3上述豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫膠體金溶液噴涂到長270mm、寬10mm的玻璃纖維墊

(Ahlstrom公司)上，37℃下干燥0.5h，得到免疫膠體金探針墊。

A.4.4含有質控線（C線）和檢測線（T線）的硝酸纖維素膜的制備：將豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋

白調整至0.42mg/mL，羊抗兔抗體調整至0.2mg/mL的工作濃度，分別噴涂于硝酸纖維素膜上，形成

檢測帶與質控帶，37℃干燥0.5h，保存?zhèn)溆谩?/p>

A.4.5試紙的組裝：在底襯（一般采用PVC材料）上順次相互搭接地粘貼樣品墊、涂覆有免疫膠體金

的玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜以及吸水紙，按照要求切割成3.98mm寬度的試紙，即制成豬繁殖與呼

吸綜合征病毒抗體膠體金免疫層析試紙。

A.5口蹄疫、非洲豬瘟、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體聯(lián)檢膠體金免疫試紙條的制備

將A1～4制備的試紙條裝入一個殼體中，再加干燥劑后密封單包裝保存。

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附圖