臨床常見微生物的鑒定-分枝桿菌屬、諾卡菌屬、放線菌屬鑒定

放線菌屬分類含分枝菌酸：諾卡菌屬、分枝桿菌屬、棒狀桿菌屬不含分枝菌酸：放線菌屬放線菌屬(Actinomyces)主要致病菌——衣氏放線菌（A.israelii)生物學性狀G+、非抗酸性絲狀菌培養(yǎng)困難，厭氧或微需氧硫磺樣顆粒（菌落）

壓片或組織切片，顯微鏡下可見顆粒呈菊花狀硫磺樣顆粒(sulfurgranule)致病性與免疫性

屬正常菌群主要引起內源性感染導致軟組織的化膿性炎癥，若無繼發(fā)感染大多呈慢性無痛性過程，并常伴有多發(fā)性瘺管形成與齲齒和牙周炎有關診斷硫磺樣顆粒分枝桿菌屬一類細長彎曲的桿菌，因有分枝生長的趨勢而命名主要特點細長彎曲，分枝狀生長細胞壁含有大量脂質（分枝菌酸）常用抗酸染色鑒定，呈抗酸染色陽性引起疾病都呈慢性，并伴肉芽腫分類結核分枝桿菌復合群非結核分枝桿菌麻風分枝桿菌分枝桿菌的分類

分類生長特性主要對人致病的分枝桿菌結核分枝桿菌復合群生長緩慢結核分枝桿菌、牛分枝桿菌非結核分枝桿菌Ⅰ組生長緩慢、光產色堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌Ⅱ組生長緩慢、暗產色瘰癘分枝桿菌Ⅲ組生長緩慢、不產色鳥-胞內分枝桿菌Ⅳ組生長快速、偶發(fā)分枝桿菌麻風分枝桿菌人工培養(yǎng)基上不生長抗酸染色由于細菌細胞壁中含大量脂質，一般不易著色，若經(jīng)加溫或延長染色時間而著色后又能抵抗強脫色劑鹽酸酒精的脫色，故又稱抗酸桿菌(acid-fastbacilli)抗酸染色法(acid-faststain)：以5％石炭酸復紅加溫染色，再用3％鹽酸酒精脫色，然后用美藍復染，則分枝桿菌呈紅色(+)，其他細菌和背景物質為藍色(-)。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)

俗稱結核桿菌，引起人類結核病致病菌主要為結核分枝桿菌（M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)世界上1/3人感染，70%在亞洲世界防治結核病日：3月24日2000年我國衛(wèi)生部宣布：中國處于結核病的緊急狀態(tài)：（五多一緩慢）

*感染人數(shù)多44.5%的人口感染，約為5.5億*患病人數(shù)多450萬*傳染源多150萬*耐藥病人多耐藥率19%-47%，多耐藥(MDRTB)*死亡人數(shù)多13萬/年*疫情下降緩慢患病率年遞降率為3.8%一、生物學特性形態(tài)與染色細長略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性培養(yǎng)特點專性需氧生長緩慢營養(yǎng)要求高，常用羅氏培養(yǎng)基生長現(xiàn)象液體：表面生長（菌膜）固體：顆粒、結節(jié)、花菜狀菌落，乳白或米黃，不透明生化反應不發(fā)酵糖類觸酶試驗陽性，耐熱觸酶試驗陰性抵抗力四不怕干燥酸（3%HCl或6%H2SO4)或堿（4%NaOH)有抵抗力堿性染料青霉素等抗生素四怕乙醇濕熱紫外線抗癆藥物（鏈霉素、異煙肼、利福平等）結核桿菌在干痰中存活6～8個月，若粘附于塵埃上，保持傳染性8～10天。在3%HCl或4%NaOH溶液中能耐受30分鐘，因而常以酸堿中和處理嚴重污染的檢材，殺死雜菌和消化粘稠物質，提高檢出率。。但對濕熱、紫外線、酒精的抵抗力弱。在液體中加熱62～63℃15分鐘，直射日光下2～3小時，75%酒精內數(shù)分鐘即死亡。變異性形態(tài)結構變異：結核桿菌的L型：顆粒狀、絲狀、Much顆粒毒力變異：卡介苗BCG：Calmette和Guérin將牛分枝桿菌經(jīng)13年230次傳代而獲得的減毒活疫苗株耐藥性變異：耐異煙肼及其他抗結核藥物的結核菌株日益增多致病物質二、致病性莢膜與細胞表面受體結合（粘附與入侵作用）保護（阻止有害物質的進入菌體）脂質索狀因子（破壞細胞，引起肉芽腫）磷脂（形成結核結節(jié)）硫酸腦苷脂（抑制吞噬體與溶酶體結合）蠟質D（引起遲發(fā)性過敏反應）蛋白質引起遲發(fā)性過敏反應所致疾病感染方式呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入機體所致疾病結核病，以肺結核常見肺部感染原發(fā)感染：外源性感染多發(fā)生于兒童（無免疫力）原發(fā)綜合征(肺門淋巴腫大等)形成結核結節(jié)（即結核肉芽腫），少數(shù)病灶擴散，引起全身TB轉歸原發(fā)后感染：外或內源性感染多見成人病灶局限引起局部TB、開放性TB（反應劇烈，干酪性壞死、空洞）肺外感染進入血液循環(huán)引起肺內、外播散，如腦、腎、腸、腹腔大多與結核分枝桿菌L型有關三、免疫性傳染、免疫、超敏反應共存免疫機制主要是以T細胞為主的細胞免疫屬于感染免疫(infectionimmunity)，又稱有菌免疫免疫與超敏反應細胞免疫為主,遲發(fā)型超敏反應同時存在郭霍現(xiàn)象注射結核桿菌于豚鼠皮下初次注射局部反應小全身擴散無免疫無超敏反應再次注射局部反應大不擴散有免疫有超敏反應以前感染過或免疫豚鼠正常豚鼠24-48小時10-14天局部紅腫、淺潰瘍局部紅腫、潰瘍不擴散，脫落后自行愈合壞死，經(jīng)久不愈有毒TB菌全身擴散皮下郭霍現(xiàn)象結核菌素試驗OT(oldtuberculin),PPD(purifiedproteinderivative)是應用結核菌素進行皮膚試驗來測定機體對結核分枝桿菌是否能引起遲發(fā)型超敏反應（Ⅳ型變態(tài)反應）的一種試驗方法前臂皮內注射PPD5單位意義48～72h紅腫硬結超過5mm,陽性，有免疫力,大于15mm,為強陽性陰性，無免疫力（四種情況除外：初染，嚴重結核，免疫力低下，老人）應用選擇卡介苗接種對象和測定卡介苗接種后的免疫效果。結核菌素試驗陰性者應接種或補種卡介苗在未接種卡介苗的人群中作結核桿菌感染的流行病學調查,了解人群自然感染率作為嬰幼兒(尚未接種過卡介苗者)結核病的輔助診斷測定腫瘤患者的細胞免疫功能四、微生物學檢查法標本處理：濃縮集菌(氫氧化鈉處理）直接鏡檢：抗酸染色分離培養(yǎng)：培養(yǎng)基、時間（2~4周后見結果）動物試驗：豚鼠等快速診斷：PCR等痰液等1、標本采集：根據(jù)結核菌感染的類型，應采取病灶部位的適當標本。

☆如肺炎結核有采取咯痰（最好取早晨第一次咯痰，挑取帶血或膿痰）；

☆腎或膀胱結核以無菌導尿或取中段尿液；

☆腸結核采取糞便標本，結核性腦膜炎進行腰脊穿刺采取腦脊液；

☆膿胸、肋膜炎、腹膜炎或骨髓結核等則穿刺取膿液。2.1直接涂片染色:

抗酸染色，若鏡檢找到抗酸性桿菌，可能是結核桿菌，但通常應報告：“查到抗酸性桿菌”。如標本中結核桿菌量少時，直接涂片不易檢出，應濃縮集菌后，再涂片染色鏡檢，以提高檢出陽性率。

2、涂片染色報告方法報告方法鏡檢結果報告方法鏡檢結果(－)末發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌/300個油鏡視野2＋1-9個抗酸桿菌/10個油鏡視野(±)1-8個抗酸桿菌/300個油鏡視野3＋1-9個抗酸桿菌/每個油鏡視野*1＋3-9個酸桿菌/100個油鏡視野4＋>10個抗酸桿菌/每個油鏡視野**:必須看100個油鏡視野沉淀集菌法：將標本用2%NaOH消化，37℃30min；或高壓滅菌液化后，3000r/min×30min，取沉渣涂片。漂浮集菌法：將標本用生理鹽水充分稀釋，再加放汽油或二甲苯0.5-1ml，振蕩15-30min后，吸取泡沫和油層接界部分涂片，兩者均用抗酸染色，報告方法同前述。2.2集菌涂片：2.3熒光顯微鏡檢查法:制片方法同前，用金胺O染色，鏡檢方法同前。3、分離培養(yǎng)：

標本預處理：咯痰和糞便標本濃縮集菌因含雜菌多，需用4%NaOH或3%HCl或6%H2SO4處理30min，然后，用離心沉淀法將結核桿菌濃縮聚集于管底，再取沉淀物0.1ml接種于固體培養(yǎng)基上，以蠟封口防止干燥。37℃培養(yǎng)4～6周后檢查結果。

4、動物試驗:取經(jīng)濃縮集菌處理的標本1.0毫升注射于豚鼠腹股溝皮下，經(jīng)3～4周飼養(yǎng)觀察，如出現(xiàn)局部淋巴結腫大，消瘦或結核菌素試驗陽性，可及時剖檢；若觀察6～8周后，仍未見發(fā)病者，也要剖檢。剖檢時應注意觀察淋巴結、肝、脾、肺等臟器有無結核病變。

5、基因診斷：涂片檢查需5×103-4/ml，培養(yǎng)需1×102/ml，標本中菌數(shù)少于此值不易被檢出，PCR技術用于快速檢測，少至每ml幾個細菌均能檢出，且速度很快，因此應用前景比較廣泛。但由于實驗器材的污染易出現(xiàn)假陽性。6、藥物敏感性實驗：國內外采用方法有絕對濃度法、比例法和擴散法，現(xiàn)在已有快速藥敏試驗商品化試劑銷售?？梢姴豢捎翰糠謽吮境霈F(xiàn)涂片陽性而培養(yǎng)卻陰性，有稱此種菌為可見不可育菌；多由于高效化療藥物的應用及機體免疫力的作用等原因形成的低活性菌或死菌。因此對每個標本都應同時進行涂片和培養(yǎng)檢查。五、防治原則預防一般性預防：衛(wèi)生宣傳、提高機體抵抗力特異性預防：發(fā)現(xiàn)和治療痰菌陽性者新生兒接種卡介苗治療一般治療：合理營養(yǎng)，注意休息抗結核藥物鏈霉素、異煙肼、利福平等治療原則：早期、聯(lián)合、適量、規(guī)律、分階段治療和堅持全程第二節(jié)

非結核分枝桿菌(nontuberculosismycobacteria)概念結核分枝桿菌、牛分枝桿菌與麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌對酸、堿比較敏感對常用的抗結核菌藥物較耐受生長溫度不如結核分枝桿菌嚴格多存在于環(huán)境中、為條件致病菌可引起結核樣病變而受到關注抗原與結核分枝桿菌有交叉特性分類第Ⅰ組：光產色菌堪薩斯分枝桿菌，引起人類肺結核樣病變第Ⅱ組：暗產色菌瘰癘分枝桿菌，引起兒童淋巴結炎第Ⅲ組：不產色菌鳥-胞內分枝桿菌，可引起結核樣病變第Ⅳ組：迅速生長菌恥垢分枝桿菌鑒別有否致病性可用抗煮沸試驗加以區(qū)別L型麻風分枝桿菌(Mycobacterium.leprae)

俗稱麻風桿菌，引起麻風，是一種慢性傳染病流行廣泛，主要分布在亞、非和拉丁美洲生物學性狀形態(tài)、染色與結核分枝桿菌相似麻風分枝桿菌是一種典型胞內菌麻風細胞體外人工培養(yǎng)至今仍未成功犰狳致病性與免疫性傳播方式破損的皮膚黏膜、呼吸道也可通過接觸傳染發(fā)病慢,病程長麻