微生物檢驗(yàn)技能-細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查

顯微鏡的使用光學(xué)部分：接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。機(jī)械部分：鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)節(jié)器、細(xì)調(diào)節(jié)器等部件。它起著支持、調(diào)節(jié)、固定等作用。顯微鏡的構(gòu)造顯微鏡的使用用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔調(diào)節(jié)光亮度低倍鏡觀察：粗調(diào)、細(xì)調(diào)高倍鏡觀察油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止顯微鏡的使用換片：另換新片，必須從第三條開始操作。用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。

不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時(shí)，特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。顯微鏡的使用注意事項(xiàng)觀察時(shí)，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時(shí)，右眼注視繪圖。拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。顯微鏡的使用注意事項(xiàng)細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察利用油鏡，結(jié)合細(xì)菌三型等染色片觀察細(xì)菌的基本形態(tài)（球狀、桿狀和螺旋狀），邊觀察邊繪圖。觀察細(xì)菌的特殊構(gòu)造：變形桿菌、綠膿桿菌----示鞭毛破傷風(fēng)梭菌、枯草桿菌----示芽胞肺炎鏈球菌---示莢膜基本形態(tài)的觀察金黃色葡萄球菌鏈球菌基本形態(tài)的觀察霍亂弧菌大腸桿菌特殊構(gòu)造的觀察變形桿菌的鞭毛特殊構(gòu)造的觀察細(xì)菌莢膜特殊構(gòu)造的觀察細(xì)菌芽胞敘述細(xì)菌的基本形態(tài)和大小。敘述使用油鏡的注意事項(xiàng)。細(xì)菌有哪些基本結(jié)構(gòu)和特殊結(jié)構(gòu)？細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)有什么臨床意義？細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)辨認(rèn)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查知道細(xì)菌的基本形態(tài)明確細(xì)菌大小和測量單位知道細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)及臨床意義學(xué)會(huì)使用光學(xué)顯微鏡油鏡觀察細(xì)菌學(xué)會(huì)顯微鏡下辨認(rèn)各種細(xì)菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)概念bacterium—是一類單細(xì)胞的原核生物。廣義：各類原核細(xì)胞型微生物（細(xì)菌、放線菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體）狹義：細(xì)菌細(xì)菌的大小測量細(xì)菌大小的單位是微米（μm）多數(shù)球菌直徑為1μm

中等大小桿菌長約為２～３μm

同一種細(xì)菌可因菌齡不同和環(huán)境等因素而有差異RBC直徑：7.5μm

細(xì)菌的形態(tài)細(xì)菌的基本形態(tài)有三種：球菌(coccus)；桿菌(bacillus)螺形菌(spirillarbacterium)球菌外觀呈球形或近似球形，直徑在1μm左右，由于繁殖時(shí)細(xì)菌分裂平面不同和分裂后菌體之間相互粘附程度不一，可有幾種排列方式。雙球菌鏈球菌葡萄球菌桿菌形態(tài)多呈直桿狀，也有的菌體稍彎；多數(shù)呈分散存在，亦有排列規(guī)則者。不同桿菌的大小、長短、粗細(xì)很不一致，均具桿菌的形態(tài)，但排列特點(diǎn)不同。桿菌桿菌棒狀桿菌鏈桿菌螺形菌菌體彎曲，長度不等，有以下幾種形態(tài)分類：弧菌，如：霍亂弧菌螺菌，如：鼠咬熱螺菌螺桿菌，如：幽門螺桿菌霍亂弧菌螺形菌細(xì)菌的結(jié)構(gòu)細(xì)菌的結(jié)構(gòu)莢膜鞭毛菌毛芽胞細(xì)胞壁細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)核質(zhì)細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)莢膜細(xì)菌代謝過程中分泌在細(xì)胞壁外的一層粘液性物質(zhì)，能牢固地與細(xì)胞壁結(jié)合，厚度≥0.2μm，邊緣明顯莢膜鞭毛某些細(xì)菌表面附著的細(xì)長呈波狀彎曲的絲狀物。根據(jù)鞭毛的數(shù)量、位置可將鞭毛菌分成四類：單毛菌；雙毛菌；從毛菌；周毛菌。有鑒別意義檢查細(xì)菌鞭毛的方法電鏡觀察特殊染色后用普通光學(xué)顯微鏡觀察壓滴法或懸滴法觀察細(xì)菌動(dòng)力接種于半固體培養(yǎng)基觀察其擴(kuò)散生長現(xiàn)象電鏡觀察鞭毛電鏡觀察鞭毛鞭毛染色光鏡觀察半固體培養(yǎng)基觀察動(dòng)力許多G-菌和個(gè)別G+菌體的周圍具有一些比鞭毛更纖細(xì)、短直且堅(jiān)硬的絲狀物，稱為菌毛，與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)無關(guān)。光學(xué)顯微鏡下看不到，須用電鏡觀察。菌毛菌毛芽胞某些細(xì)菌在一定環(huán)境條件下，能在菌體內(nèi)部形成一個(gè)圓形或卵圓形小體，是細(xì)菌的休眠形式。產(chǎn)生芽胞的細(xì)菌都是G+菌。不同細(xì)菌的芽胞形態(tài)、大小、位置有所差異，是鑒別細(xì)菌的指標(biāo)之一。芽胞芽胞革蘭染色技術(shù)基本技能單項(xiàng)訓(xùn)練患者王某，男，63歲，入院后經(jīng)氣管插管手術(shù)48h后出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咯痰，X線檢查顯示有較新炎癥病灶，初步判斷為肺部感染。取病人痰液標(biāo)本送檢驗(yàn)科微生物室檢驗(yàn)。病人痰液呈磚紅色似果醬樣，粘稠。請問該病人可能是何種病原菌感染？將如何鑒定？可將細(xì)菌分為兩大類，是對細(xì)菌進(jìn)行鑒定的最基本的檢驗(yàn)技術(shù)，可將細(xì)菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。兩類細(xì)菌致病性不同。對藥物的敏感性均不相同。革蘭染色的臨床意義能力目標(biāo)掌握細(xì)菌革蘭染色的操作方法掌握細(xì)菌革蘭染色的臨床意義掌握細(xì)菌革蘭染色的注意事項(xiàng)了解細(xì)菌革蘭染色的原理鞏固顯微鏡操作技術(shù)和無菌技術(shù)素質(zhì)目標(biāo)注意生物安全注意操作規(guī)范細(xì)菌菌體微小、而且折光率低，在顯微鏡下特別是在油鏡下幾乎與背景無反差，很難看清楚，如將其染色，使折光率增大，便容易觀察。由于菌體的性質(zhì)及各部分對某些染料的著色性不同，因此可以利用不同的染色方法來區(qū)別不同的細(xì)菌及其結(jié)構(gòu)。細(xì)菌染色法分單染法和復(fù)染法應(yīng)用最廣泛的是革蘭染色法。革蘭染色法能將細(xì)菌分為G+菌(紫色）和G-菌（紅色）。涂片→干燥→固定→染色革蘭染色法

革蘭染色法是微生物學(xué)中常用的一種染色方法，該染色法由丹麥醫(yī)生Gram于1884年首創(chuàng)，故名。

細(xì)菌革蘭染色原理通透性機(jī)制：

G+菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，脂類含量少，乙醇不易透入，反而可使細(xì)胞壁脫水形成一道屏障，阻止染料從細(xì)胞內(nèi)滲出；G-菌細(xì)胞壁較疏松，含脂類物質(zhì)多，易被乙醇溶解，使其通透性增大，細(xì)胞內(nèi)的結(jié)晶紫―碘復(fù)合物易被溶解滲出易脫色。細(xì)菌革蘭染色原理化學(xué)機(jī)制：

G+菌細(xì)胞內(nèi)含大量核糖核酸鎂鹽，與結(jié)晶紫―碘復(fù)合物結(jié)合牢固，另外，其等電點(diǎn)較低，結(jié)合的堿性染料多而牢固，因而染成紫色。結(jié)晶紫初染全部紫色碘液媒染全部紫色乙醇脫色G-菌無色G+菌紫色

復(fù)紅復(fù)染G-菌紅色

G+菌紫色革蘭染色各步驟時(shí)細(xì)菌的顏色革蘭染色操作步驟涂片制備涂片：干燥：固定：通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。涂片干燥固定染色水洗、吸干鏡檢制備涂片標(biāo)本→染色革蘭染色操作步驟

鏡檢涂片滴水取菌固定結(jié)晶紫（1min）水洗水洗碘液（1min）

乙醇脫色干燥水洗復(fù)紅0.5min水洗革蘭染色操作步驟革蘭染色操作步驟革蘭染色結(jié)果革蘭陰性桿菌革蘭陽性鏈球菌革蘭染色結(jié)果革蘭染色結(jié)果（一）玻片要盡量潔凈。（二）菌齡要適當(dāng)，一般在對數(shù)生長期取材，菌齡過長染色性容易改變。（三）菌量要適當(dāng)，菌膜不宜涂得太厚。（四）涂菌動(dòng)作要輕，防止菌液崩濺。（五）行火焰固定時(shí)，既要?dú)⑺兰?xì)菌，又不能破壞細(xì)菌原有形態(tài)。（六）粘有細(xì)菌的接種環(huán)要及時(shí)火焰滅菌。（七）注意檢查染液質(zhì)量，染液中不應(yīng)有沉淀物。另外，在染色中染液不能干涸。（八）掌握好脫色時(shí)間，脫色時(shí)間過長或過短均會(huì)造成染色性改變。影響革蘭染色結(jié)果的因素歸納細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查常用的方法和用途。敘述細(xì)菌革蘭染色的步驟、結(jié)果及臨床意義。影響革蘭染色結(jié)果的因素有哪些？抗酸染色技術(shù)基本技能單項(xiàng)訓(xùn)練診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)

患者王某，男，50歲，出現(xiàn)低熱、咳嗽、咯痰二十余天，X線檢查顯示肺部有炎癥病灶，初步判斷為肺部感染。取病人痰液標(biāo)本送檢驗(yàn)科微生物室檢驗(yàn)。病人痰液帶血絲。請問該病人可能是何種病原菌感染？將如何鑒定？能力目標(biāo)會(huì)操作細(xì)菌抗酸染色能正確觀察細(xì)菌抗酸染色結(jié)果知道細(xì)菌抗酸染色的臨床意義知道細(xì)菌抗酸染色的原理、影響因素學(xué)習(xí)目標(biāo)素質(zhì)目標(biāo)

進(jìn)一步強(qiáng)化生物安全的意識樹立嚴(yán)肅認(rèn)真、實(shí)事求是、高度負(fù)責(zé)的科學(xué)態(tài)度，具有良好的職業(yè)素質(zhì)和崇高的職業(yè)道德?？顾崛旧ǚ种U菌屬的細(xì)菌（包括結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌等）為抗酸性細(xì)菌，一般染色法不易著色，須用抗酸染色法。分枝桿菌呈紅色(+)其他細(xì)菌和背景為藍(lán)色(-)。實(shí)驗(yàn)原理分枝桿菌的細(xì)胞壁內(nèi)含有大量的脂質(zhì)，主要是分枝菌酸，它包圍在外面，所以分枝桿菌一般不易著色，要經(jīng)過加熱和延長染色時(shí)間來促使其著色。但分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結(jié)合后，就很難被酸性脫色劑脫色，故名抗酸染色(齊-尼氏抗酸染色法)。實(shí)驗(yàn)材料細(xì)菌：卡介苗染液：石炭酸復(fù)紅液、3%鹽酸酒精、堿性美蘭溶液其它：接種環(huán)、酒精燈、載玻片等

染色步驟1、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備涂片干燥固定2、染色染色步驟1）初染：用玻片夾夾持涂片標(biāo)本，滴加石炭酸復(fù)紅2-3滴，在火焰高處徐徐加熱，切勿沸騰，出現(xiàn)蒸汽即暫時(shí)離開，若染液蒸發(fā)減少，應(yīng)再加染液，以免干涸，加熱3-5分鐘，待標(biāo)本冷卻后用水沖洗。2）脫色：

3%鹽酸酒精脫色30秒至1分鐘，用水沖洗。3）復(fù)染：用堿性美蘭溶液復(fù)染1分鐘，用水沖洗后用吸水紙吸干。3、油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)核桿菌呈紅色，常堆積成團(tuán)，排列無序，偶呈分枝狀生長。偶爾有桿菌著色不均，呈顆粒狀者。背景及非抗酸性細(xì)菌呈蘭色?？顾崛旧Y(jié)果抗酸染色結(jié)果抗酸