程序性細胞死亡與細胞衰老課件

2025/1/31第十三章程序性細胞死亡

與細胞衰老●程序性細胞死亡（programmmedcelldeath,PCD）●細胞衰老（cellageing或cellsenescence）2025/1/32程序性細胞死亡動物細胞程序性死亡細胞凋亡（apoptosis）細胞壞死（necrosis）細胞自噬（autophagy）植物細胞與酵母細胞的程序性死亡植物細胞的程序性死亡：木質部管狀細胞的成熟過程，植物細胞在受到真菌或細菌感染后會發(fā)生主動快速死亡。死亡細胞的殘余被細胞壁固定在原位，被液泡中水解酶消化。酵母細胞的程序性死亡：與動物程序性死亡類似。2025/1/33細胞凋亡(Apoptosis)●細胞凋亡的概念和特征●細胞凋亡的生理意義：對于動物個體的正常發(fā)育，自穩(wěn)態(tài)的維持，免疫耐受的形成，腫瘤監(jiān)控等多種生理及病理過程具有重要意義。蝌蚪尾的消失，發(fā)育過程中手和足的成形過程；脊椎動物的神經系統(tǒng)的發(fā)育；凋亡不足導致腫瘤在內的多種疾病，調亡過度導致機體免疫功能的喪失?！窦毎蛲龅臋z測方法●細胞凋亡的分子機制2025/1/34細胞凋亡的概念和特征●細胞凋亡生物學意義：強調這種細胞的死亡方式是自然的生理學過程，是受基因調控的主動的生理性細胞自殺行為?！駝游锛毎蛲龅倪^程，在形態(tài)學上分為三個階段：◆凋亡的起始：細胞表面的特化結構如微絨毛消失，細胞間接觸的消失，但細胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內質網上脫離，內質網囊腔膨脹，并逐漸與質膜融合；染色質固縮，形成新月形帽狀結構等形態(tài)，沿著核膜分布；

◆凋亡小體的形成：核染色質斷裂為大小不等的片段，與某些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞質膜所包圍。細胞表面產生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體；◆凋亡小體逐漸為鄰近的細胞或體內的吞噬細胞所吞噬，凋亡細胞的殘余物質被消化后重新利用。2025/1/35細胞凋亡的檢測方法◆形態(tài)學觀測：染色法（臺盼藍）、透射和掃描電鏡觀察。◆DNA電泳：DNA片段就呈現出梯狀條帶?！鬞UNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標記法。◆彗星電泳法（cometassay）：將細胞裂解處理，電泳并用熒光染料染色，凋亡細胞DNA降解片斷在電場中泳動速度快，使細胞核呈彗星式圖案。◆流式細胞分析：凋亡細胞DNA斷裂和丟失，呈亞二倍體狀態(tài)，用碘化丙腚染色使DNA產生激發(fā)熒光。

2025/1/36細胞凋亡的分子機制●誘導細胞凋亡的因子●Caspase家族與凋亡

◆Caspase

◆Caspase依賴性的細胞凋亡

▲死亡受體起始的外源途徑

▲線粒體起始的內源途徑◆Caspase非依賴性的細胞凋亡◆生死抉擇：細胞凋亡的調控2025/1/37誘導細胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，

射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等。◆化學及生物因子：包括活性氧基團和分子，鈣離子載體，維生素K3，視黃酸，細胞毒素，DNA和蛋白質合成的抑制劑，正常生理因子（激素，細胞生長因子等）失調以及腫瘤壞死因子

（TNF

）處理等。2025/1/38Caspase◆Caspase：是一組存在于細胞質中具有類似結構的蛋白酶，活性位點均包含半胱氨酸殘基，裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（Cysteineasparticacicspecificprotease），即Caspase。負責選擇性切割蛋白質，使靶蛋白活化或失活。◆線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現ced3，ced4基因促進細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是白介素-1β轉換酶（Interleukin-1β

convertingenzyme，ICE），被命名Caspase-1：◆哺乳動物細胞Caspase家族成員有15種。◆細胞凋亡的分為激活期和執(zhí)行期兩個階段。2025/1/39細胞凋亡分為兩個階段激活期：前期細胞應答死亡信號，起始Caspase活化。凋亡信號刺激→酶原分子在特異性的Asp位點被切割→形成兩個大小亞基的異二聚體→具有活性的Caspase；執(zhí)行期：后期執(zhí)行Caspase活化，執(zhí)行細胞死亡程序。起始Caspase招募執(zhí)行Caspase酶原分子后→進行切割→產生具有活性的執(zhí)行Caspase→切割細胞內重要的結構和功能蛋白→細胞凋亡。已知執(zhí)行Caspase底物約280種。起始Caspase和執(zhí)行Caspase組成細胞內凋亡信號的聯(lián)級分子網絡，凋亡程序一旦啟動，網絡頂端起始Caspase首先活化，切割下游Caspase酶原，使得凋亡信號在短時間內迅速放大并傳遞到整個細胞，產生凋亡效應。2025/1/310死亡受體起始的外源途徑▲凋亡信號通路：死亡配體主要是腫瘤壞死因子（TNF)家族成員，死亡配體的生物學功能是通過與細胞表面的受體結合來實現的，TNF-R1和Fas是死亡受體家族的代表成員，它們的胞質部分均含有死亡結構域（DD），負責招募凋亡信號通路中的信號分子?！e例：配體與Fas結合→Fas聚合→Fas通過胞質區(qū)的死亡結構域招募接頭蛋白FADD和Caspases-8酶原→形成死亡誘導復合物DISC→Caspases-8酶原在復合物中通過自身切割被激活→切割執(zhí)行者Caspases-3酶原→產生有活性的Caspases-3→導致細胞凋亡?；罨腃aspases-8酶還通過切割Bcl-2家族成員的Bid將凋亡信號傳遞到線粒體，引發(fā)內源途徑，信號進一步放大。2025/1/311線粒體起始的內源途徑◆細胞受到內部或外部的凋亡信號刺激時，線粒體外膜的通透性會發(fā)生改變，向細胞質基質中釋放出凋亡相關因子，引發(fā)細胞凋亡。哺乳動物細胞接受凋亡信號刺激，CytC從線粒體釋放到細胞質中，與另一個凋亡因子Apaf-1結合，誘導細胞凋亡發(fā)生。◆線粒體外膜通透性改變主要受到Bcl-2蛋白家族的調控，是Ced-9在哺乳類中的同源物，含有一個或多個BH結構域，定位在線粒體外膜上，或接受信號后轉移到線粒體外膜上?！艏毎邮艿蛲鲂盘柡蟠俚蛲鲆蜃覤ax和Bak發(fā)生寡聚化，從胞質中轉移到線粒體外膜上，與膜上陰離子通道蛋白作用，使通道開放，線粒體內凋亡因子（CytC）釋放到細胞質基質中，引發(fā)細胞凋亡。◆Bcl-2、線粒體與細胞凋亡2025/1/312Caspase非依賴性的細胞凋亡◆凋亡誘導因子（AIF）：是能夠誘導Caspase非依賴性細胞凋亡的因子，位于線粒體外膜，凋亡過程中，AIF從線粒體轉移到細胞基質內，進而進入細胞核，引起核內DNA凝集并斷裂成50kp大小的片段?！粝拗菩詢惹忻窯（EndoG）：屬于Mg2+依賴性的核酸酶家族，定位于線粒體，主要功能負責線粒體DNA的修復和復制。受到凋亡信號的刺激后，EndoG從線粒體釋放出來進入細胞核，對DNA進行切割。在Caspase未被激活的情況下，產生典型的以核小體為單位的DNA片段。2025/1/313生死抉擇：細胞凋亡的調控Caspase抑制因子：直接與Caspase活性分子結合，阻抑其對底物的切割作用，包括c-IAP家族7個成員，c-FLIP，BAR和ARC；所有IAP家族成員都具有70個氨基酸殘基組成的BIR結構域，對抑制凋亡是必需的。IAP家族成員的抗凋亡作用也能被特異的抑制因子解除，當凋亡程序啟動后，有兩種蛋白Smac/DIABLO和Omi/HtrA2與CytC一起從線粒體中釋放，兩種蛋白含有IAP結合基序，與IAP結合并釋放出被IAP封閉的Caspase。內源性Caspase抑制因子2025/1/314名稱抑制底物NAIP(BIRC1)Caspase-3,-7c-IAP1

(BIRC2)Caspase-3,-7c-IAP2(BIRC3)Caspase-3,-7XIAP(BIRC4)Caspase-3,-7,-9Survivin(BIRC5)Caspase-3,-7Livin(BIRC7)Caspase-3,-7,-9ILP-2(BIRC8)Caspase-9c-FLIP(I-FLICE)Caspase-8,-10ARCCaspase-2,-8BARCaspase-82025/1/315細胞壞死（necrosis）2025/1/316細胞自噬（autophagy）◆正常的動物細胞為了維持細胞內環(huán)境的動態(tài)平衡，需要不斷地降解功能失常的或不需要的細胞結構，如各種蛋白質、細胞器以及各種細胞組分：

▲壽命短的蛋白質通過泛素-蛋白酶體系降解；

▲壽命較長的細胞結構及蛋白質通過細胞自噬途徑?！艏毎允蓞⑴c了細胞死亡的過程，是與細胞凋亡不同的另一種程序性死亡方式。線蟲幼蟲在營養(yǎng)不良時會通過細胞自噬降解自身的部分細胞維持個體存活。細胞自噬不需要吞噬細胞就能自我銷毀，可能是細胞凋亡的補充途徑。2025/1/317細胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)●細胞衰老的概念及特征●細胞衰老的分子機制●細胞衰老與個體衰老和癌癥的關系2025/1/318細胞衰老的概念及特征●概念：關于細胞增殖能力和壽命是有限的觀點。細胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限●細胞衰老過程形態(tài)結構方面的變化◆細胞核的變化：體外培養(yǎng)的二倍體細胞，細胞核隨著細胞分裂次數的增加不斷增大，細胞核的核膜內折（invagination）、染色質固縮化。

◆內質網的變化：衰老動物內質網成分彌散性地分散于核周胞質中，粗面內質網的總量減少了?！艟€粒體的變化：細胞中線粒體的數量隨齡減少，而其體積則隨齡增大?！糁旅荏w的生成：衰老的動物細胞致密體積累，由溶酶體或線粒體轉化而來?！裟は到y(tǒng)的變化：衰老的細胞，其膜的流動性降低、韌性減小，衰老細胞間隙連接減少。2025/1/319細胞來源人胚肺成纖維細胞中年人成纖維細胞老年人成纖維細胞可增殖代數40-60202-4不同年齡來源的人成纖維細胞的增殖代數2025/1/320細胞衰老的分子機制●復制衰老的機制：端粒酶的發(fā)現證實端粒長度與衰老有著密切的關系，端粒被認為是細胞的“分子時鐘”。pRb蛋白與轉錄因子E2F家族結合阻抑其活性，E2F負責轉錄G1/S期轉換以及DNA復制過程中的基因，E2F被pRb封閉；CDK磷酸化pRb細胞可進入S期；如果CDK活化被抑制，細胞停留在G1期，阻斷細胞周期正常運行，引發(fā)復制型細胞衰老。CDK抑制因子（p16和p21）引起衰老。

●脅迫誘導的早熟性衰老：代謝過程中產生的活性氧基團或分子（ROS---O2-，OH-，H2O2），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導致衰老?！駟渭毎c衰老:酵母染色體外環(huán)型rDNA（ERC）的積累，ERC集中在母細胞，不進入子細胞，導致母細胞ERC積累而衰老。2025/1/3212025/1/3222025/1/3232025/1/324細胞色素c誘導的凋亡細胞DNA電泳圖1．細胞色素c誘導0h2．細胞色素c誘導1h3．細胞色素c誘導2h4．細胞色素c誘導3h5．細胞色素c誘導4h6．陰性對照7．Marker

（自趙允、翟中和）2025/1/3252025/1/326

a正常T細胞雜交瘤細胞b凋亡細胞(掃描電鏡)c凋亡細胞(透射電鏡)2025/1/327caspase超家族成員及其在細胞凋亡過程中的功能2025/1/328