《人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞檢測技術(shù)規(guī)范》

團體標(biāo)準(zhǔn)

T/CRHIAXXXXX—XXXX

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞檢測技術(shù)規(guī)范

Technicalspecificationforhumanumbilicalcordmesenchymalstemcelldetection

點擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

中國生物工程學(xué)會發(fā)布

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人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞檢測技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件給出了人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量檢測的技術(shù)要求和檢測方法。

本文件適用于人源臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件,

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T42076.1-2022生物技術(shù)細(xì)胞計數(shù)第1部分：細(xì)胞計數(shù)方法通則

WS213丙型肝炎診斷

WS273梅毒診斷

WS293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

間充質(zhì)干細(xì)胞MesenchymalStemCells

是中胚層來源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，廣泛存在于全身多種組織

中，可在體外培養(yǎng)擴增，并在特定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞

等。

3.2

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞humanumbilicalcordmesenchymalstemcells

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是指來源于臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞。

3.3

流式細(xì)胞術(shù)flowcytometry

利用流式細(xì)胞儀快速定量分析細(xì)胞群的物理化學(xué)特征以及根據(jù)這些物理化學(xué)特征精確分選細(xì)胞的

技術(shù)，主要包括流式分析和流式分選兩部分。

3.4

細(xì)胞表型cellphenotype

1

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是某種細(xì)胞或者細(xì)胞亞群表達(dá)一些重要的抗原分子的情況，明確細(xì)胞表達(dá)這些抗原分子的情況可以

從一定程度上判斷這群細(xì)胞的某些特征，也可以從一定程度上判斷該群細(xì)胞的功能狀態(tài)。

3.5

成骨誘導(dǎo)分化osteogenicdifferentiation

通過特定的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞，進(jìn)而形成骨組織的過程。

3.6

成脂誘導(dǎo)分化adipogenicdifferentiation

通過特定的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的過程。

3.7

成軟骨誘導(dǎo)分化chondrogenicdifferentiation

特定的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的過程。

3.8

核型karyotype

細(xì)胞有絲分裂中期所具備的整套染色體數(shù)目、長度、著絲點位置、隨體、主縊痕和次縊痕等特征。

3.9

干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測stemcellinhibitiononlymphocyteproliferation

干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測是用于評估干細(xì)胞對免疫應(yīng)答的調(diào)控作用的方法。常見的檢測方法

包括：干細(xì)胞共培養(yǎng)實驗和細(xì)胞因子分析。

3.10

干細(xì)胞共培養(yǎng)實驗stemcellcocultureexperiment

將干細(xì)胞與淋巴細(xì)胞一起培養(yǎng)，并觀察干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖的影響。

4技術(shù)要求

4.1總則

4.1.1實驗室各設(shè)備在使用前需認(rèn)真閱讀設(shè)備說明書，確認(rèn)設(shè)備狀態(tài)，規(guī)范操作，使用后需填寫設(shè)備

使用記錄。

4.1.2實驗所需試劑在使用前需認(rèn)真閱讀產(chǎn)品說明書，注意易燃、有毒有害試劑的規(guī)范操作，使用前

后需做試劑出入庫登記。

4.2重要質(zhì)量屬性

4.2.1細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時呈紡錘形和梭形的成纖維細(xì)胞態(tài)，形態(tài)均一。

2

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4.2.2細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞活率

細(xì)胞活率≥90%。

4.2.3染色體核型

正常核型應(yīng)為46，XX或46，XY。

4.2.4細(xì)胞表型

表1細(xì)胞表型要求

Positive(≥95%+)Negative(≤2%+)

CD105CD45

CD73CD34

CD90CD14orCD11b

CD79αorCD19

HLA-DR

4.2.5三系分化

具有成骨、成軟骨、成脂的分化潛能。

4.2.6成瘤性

免疫缺陷動物（如小鼠）體內(nèi)成瘤試驗結(jié)果為陰性。

4.2.7微生物

細(xì)菌、真菌、支原體、HIV、HAV、HBV、HCV、HTLV、HCMV、HPVB19、EBV、TP、COX應(yīng)為

陰性。

4.2.8干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制

評估干細(xì)胞對免疫應(yīng)答的調(diào)控作用，具體要求見檢測方法。

5檢測方法

5.1細(xì)胞形態(tài)

二維培養(yǎng)條件下，用明視場細(xì)胞顯微鏡進(jìn)行觀察。

5.2細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞活率

按照GB/T42076.1-2022的方法檢測。

5.3染色體核型

按照《中華人民共和國藥典》檢測。

5.4細(xì)胞表型

按照附錄B的方法檢測。

3

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5.5三系分化

5.5.1成骨分化

按照附錄C的方法檢測。

5.5.2成軟骨骨分化

按照附錄D的方法檢測。

5.5.3成脂分化

按照附錄E的方法檢測。

5.6成瘤性

按照附錄F的方法檢測。

5.7微生物

5.7.1細(xì)菌

按照《中華人民共和國藥典》中“1101無菌檢查法”檢測。

5.7.2真菌

按照《中華人民共和國藥典》中“1101無菌檢查法”檢測。

5.7.3支原體

按照《中華人民共和國藥典》中“3301支原體檢查法”檢測。

5.7.4HAV

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》檢測。

5.7.5HBV

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》檢測。

5.7.6HCV

按照WS213檢測。

5.7.7HIV

按照WS293檢測。

5.7.8HTLV

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》檢測。

5.7.9HCMV

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》檢測。

5.7.10HPVB19

4

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按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》檢測。

5.7.11EBV

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》檢測。

5.7.12TP

按照WS273檢測。

5.7.13COX

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》檢測。

5.7.14干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測

按照附錄G的方法檢測。

5

T/CRHIAXXXXX—XXXXAA

附錄A

（資料性）

人間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量檢測表

人間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量檢測表格式見表A.1。

表A.1人間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量檢測表

樣品名稱

信息編碼

檢測人員

細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞活率

染色體核型

細(xì)胞表型

成骨分化

三系分化成軟骨分化

成脂分化

成瘤性

細(xì)菌

真菌

支原體

質(zhì)量屬性

HAV

HBV

HCV

微生物HIV

HTLV

HCMV

HPVB19

EBV

TP

COX

干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測

復(fù)核人員

放行人員

備注

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BB

附錄B

（資料性）

細(xì)胞表型檢測流式細(xì)胞法

B.1儀器和設(shè)備

使用的儀器和設(shè)備如下:

6流式細(xì)胞儀；

7水平離心機；

8電子天平

B.2試劑

使用的試劑如下：

9磷酸鹽緩沖液：pH7,4；

10牛血清白蛋白(BSA):純度≥98%；

11疊氮鈉(NaN)；

12抗人CD105、CD73，CD90、CD11b、CD19、CD31，CD34、CD45，HLA-DR抗體及同型對照抗體；

13洗滌液，抗體稀釋液

B.3樣品保存

洗滌液和標(biāo)記后的樣品于2℃-8℃保存。相關(guān)抗體遵照說明書保存。

B.4檢測步驟

B.4.1樣品準(zhǔn)備

收集細(xì)胞，使用水平離心機300g離心4min，棄上清。然后用洗滌液清洗一遍。使用水平離心機300g

離心4min棄上清。

B.4.2抗體孵育

按照抗體說明書進(jìn)行稀釋使用。抗體孵育結(jié)束后用洗滌液清洗兩遍，使用水平離心機300g離心4min,

棄上清。

B.4.3過濾上機

用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過40m濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀應(yīng)用手冊上機檢測。

B.4.4圈門設(shè)定原則

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首先根據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)Isotyp

對照組熒光強度，在分群的基礎(chǔ)上畫出陽性細(xì)胞群2，排除沒有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞?？贵wIsotype

作為陰性對照。

B.4.5結(jié)果分析

得到的檢測結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。

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CC

附錄C

（資料性）

成骨分化檢測茜素紅S染色法

C.1儀器和設(shè)備

使用的儀器和設(shè)備如下:

——血球計數(shù)板；

——明視場顯微鏡；

——水平離心機。

C.2試劑

使用的試劑如下：

——磷酸鹽緩沖液：pH7,4；

——消化酶；

——臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）；

——成骨誘導(dǎo)液；

——茜素紅S染色試劑盒。

C.3檢測步驟

C.3.1細(xì)胞消化

使用水平離心機離心收集細(xì)胞于離心管中，用無帶磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成

氣泡或者殘留細(xì)胞團塊。

C.3.2細(xì)胞計數(shù)

根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板及明視場顯微鏡計算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。

C.3.3細(xì)胞接種并誘導(dǎo)

細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書。誘導(dǎo)14天至21天。

C.3.4鈣結(jié)節(jié)染色

鈣結(jié)節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色試劑盒說明書進(jìn)行。

C.3.5結(jié)果分析

顯微鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。

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附錄D

（資料性）

成脂分化檢測油性O(shè)染色法

D.1儀器和設(shè)備

使用的儀器和設(shè)備如下:

——血球計數(shù)板；

——明視場顯微鏡；

——水平離心機。

D.2試劑

使用的試劑如下：

——磷酸鹽緩沖液：pH7,4；

——消化酶；

——臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）；

——成脂誘導(dǎo)液；

——油紅O染色試劑盒。

D.3檢測步驟

D.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備

使用水平離心機離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成

氣泡或者殘留細(xì)胞團塊。使用血球計數(shù)板及明視場顯微鏡計算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。

D.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)

細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成脂誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書，誘導(dǎo)14天至21天。

D.3.3脂滴染色

脂滴染色根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進(jìn)行。

D.3.4結(jié)果分析

顯瀲鏡下可見橙紅色的脂滴，脂肪細(xì)胞中含大小不等的脂滴。

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EE

附錄E

（資料性）

成軟骨分化檢測阿爾新藍(lán)染色法

E.1儀器和設(shè)備

使用的儀器和設(shè)備如下:

——血球計數(shù)板；

——明視場顯微鏡；

——水平離心機。

E.2試劑

使用的試劑如下：

——磷酸鹽緩沖液：pH7,4；

——消化酶；

——臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)；

——成軟骨誘導(dǎo)液；

——阿爾新藍(lán)染色試劑盒。

E.3檢測步驟

E.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備

使用水平離心機離心收集細(xì)胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成

氣泡或者殘留細(xì)胞團塊。使用血球計數(shù)板及明視場顯微鏡計算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。

E.3.2細(xì)胞接種并誘導(dǎo)

細(xì)胞接種方式、密度及誘導(dǎo)步驟均遵循成軟骨誘導(dǎo)液產(chǎn)品說明書。誘導(dǎo)14天至21天。

E.3.3軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)染色

軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)染色根據(jù)阿爾新藍(lán)試劑盒說明書進(jìn)行。

E.3.4結(jié)果分析

顯微鏡下可見深藍(lán)色的軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)。

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附錄F

（資料性）

成瘤性檢測免疫缺陷小鼠檢測法

F.1儀器和設(shè)備

使用的儀器和設(shè)備如下:

——血球計數(shù)板;

——明視場顯微鏡；

——水平離心機。

F.2試劑

使用的試劑如下：

——磷酸鹽緩沖液：pH7,4；

——消化酶；

——臺盼藍(lán)染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.4%(質(zhì)量濃度)。

F.3檢測步驟

F.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備

使用水平離心機離心收集細(xì)胞于離心管中，用尤菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或者

殘留細(xì)胞團塊。使用血球計數(shù)板及明視場顯微鏡計算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度

F.3.2細(xì)胞移植

將1×107個人間充質(zhì)干細(xì)胞注射到6至8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，設(shè)置空白對照組(空白組注射

與產(chǎn)品對應(yīng)的溶媒)陰性對照組(人二倍體細(xì)胞)陽性對照組(人腫瘤細(xì)胞系，按照腫瘤細(xì)胞系接種要求的

數(shù)量注射)。

F.3.3腫瘤觀察

接種后觀察16周，每周測量體重、腫瘤大小。若荷瘤小鼠腫瘤超過2000毫米或者腫瘤潰爛或體

重下降，可考慮執(zhí)行人道終點。16周后剝離小鼠身上腫瘤，行大體觀察，瘤體稱重，計算成瘤率。

F.3.4結(jié)果分析

成瘤率按式進(jìn)行計算:Z=N/M×100%…………（1）

式中：

Z——成瘤率；

M——接種小鼠總數(shù)；

N——荷瘤小鼠總數(shù)。

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GG

附錄G

（資料性）

干細(xì)胞對淋巴細(xì)胞增殖抑制檢測干細(xì)胞共培養(yǎng)法

G.1儀器和設(shè)備

使用的儀器和設(shè)備如下:

——二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱；

——水平離心機；

——血球計數(shù)板；

——48孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

G.2試劑

使用的試劑如下：

——人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基；

——絲裂霉素C；

——生理鹽水；

——紅細(xì)胞裂解液；

——1640培養(yǎng)基；

——胎牛血清。

G.3檢測步驟及要求

G.3.1人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

G.3.1.1檢測步驟

檢查步驟如下：

——解凍P4代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為80-90%；

——加入絲裂霉素C放入培養(yǎng)箱中37攝氏度孵育1小時；

——棄去原培養(yǎng)基，加入生理鹽水，洗滌2次；

——消化收集細(xì)胞，計數(shù)，用10%胎牛血清-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，接種至48孔板中，

每孔500uL培養(yǎng)基，各3個復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少4小時。

G.3.1.2檢測結(jié)果

應(yīng)滿足：貼壁后的干細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，細(xì)胞不增殖，細(xì)胞融合度80-90%。

G.3.2淋巴細(xì)胞分離液分離外周血獲得外周血單個核細(xì)胞

G.3.2.1檢測步驟

檢查步驟如下：

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——淋巴細(xì)胞分離液分離得到外周血單個核細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，1000rpm離心5分

鐘，得到細(xì)胞沉淀用5mL10%胎牛血清-1640培養(yǎng)基重懸貼壁培養(yǎng)2小時；

——收集懸浮細(xì)胞用生理鹽水洗滌一次，計數(shù)外周血單個核細(xì)胞，離心棄上清；

——外周血單個核細(xì)胞沉淀加入2mL細(xì)胞增殖示蹤熒光探針染液重懸細(xì)胞沉淀，37℃孵育5分鐘；

——加入4mL10%胎牛血清-1640培養(yǎng)基稀釋，1500rpm離心5分鐘；

——棄上清,用10%胎牛血清-1640培養(yǎng)基洗滌2次，計數(shù)，棄上清，10%胎牛血清-1640培養(yǎng)基重

懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。

G.3.2.2檢測結(jié)果

應(yīng)滿足：分離得到白色的單個核細(xì)胞，細(xì)胞增殖示蹤熒光探針染液染色后