《人胃腫瘤類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制與保藏操作指南》

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/××××—××××

人胃腫瘤類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制與保藏

操作指南代替GB/T17608-1998

Guidelinesfortheconstruction,qualitycontrolandpreservationofhumangastric

tumororganoids

（征求意見稿）

20×-××-××發(fā)布20×-××-××實(shí)施

中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)發(fā)布

人胃腫瘤類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制與保藏操作指南

1．范圍

本文件提供了胃腫瘤類器官構(gòu)建、質(zhì)量控制與保藏的基本原則、操作流程方法以及

檢測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法的指導(dǎo)與建議。

本文件適用于胃腫瘤類器官的培養(yǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇、質(zhì)量控制與保藏過(guò)程。

2．規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注

日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版

本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T37864—2019生物樣本庫(kù)質(zhì)量和能力通用要求

GB/T38736—2020人類生物樣本保藏倫理要求

GB/T42060—2022醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室樣品采集、運(yùn)送、接收和處理指南

WS233—2017病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則

T/NAHIEM6-2018醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)通用要求

3．術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1胃腫瘤類器官gastrictumororganoid

由病理診斷為胃腫瘤的患者自體腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶樣本中提取的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)

3D培養(yǎng)形成的，可以在體外擴(kuò)增并重現(xiàn)原始腫瘤的病理形態(tài)和遺傳特征的類器官。

3.2胃腫瘤類器官培養(yǎng)基culturemediumforgastrictumororganoids

可以實(shí)現(xiàn)體外模擬胃腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及擴(kuò)增所需微環(huán)境，能誘導(dǎo)胃腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期體外

擴(kuò)增培養(yǎng)，維持原始腫瘤細(xì)胞特性，實(shí)現(xiàn)體外胃腫瘤組織類器官的長(zhǎng)期存活的培養(yǎng)介質(zhì)。

3.33D培養(yǎng)基質(zhì)culturematrix

組成成分包括但不限于層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，添加物

包括但不限于生長(zhǎng)因子、小分子化合物和/或微量元素、激素。在室溫條件下能夠聚合形

成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)和功能，能夠?yàn)槲改[瘤細(xì)胞的

生長(zhǎng)提供支架。

3.4類器官傳代organoidpassage

采用物理吹打聯(lián)合化學(xué)酶消化的方法將培養(yǎng)至一定大小、狀態(tài)良好的類器官解離為

小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液，再重新接種于與原培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)體系內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行類器

1

官培養(yǎng)。新一代類器官與原來(lái)的類器官具有相同的形態(tài)功能特征。

3.5類器官凍存organoidcryopreservation

需將類器官解離成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞懸液，加入凍存保護(hù)劑，程序降溫后置于-196℃

液氮中低溫保存，使其暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而保留其細(xì)胞特性。凍存后的類器官在需要時(shí)

能夠通過(guò)復(fù)蘇用于試驗(yàn)。

3.6類器官?gòu)?fù)蘇organoidthawing

將處于深低溫凍存的類器官取出并恢復(fù)其繼續(xù)生長(zhǎng)狀態(tài)的過(guò)程。

3.7倫理審查委員會(huì)ethicsreviewcommittee

負(fù)責(zé)對(duì)科學(xué)研究中涉及的倫理道德進(jìn)行評(píng)估和審查的專門組織。

3.8知情同意informedconsent

有自主判斷能力的供體或其法定監(jiān)護(hù)人，在獲得并充分了解樣本和數(shù)據(jù)捐贈(zèng)相關(guān)信

息之后，供體所受到的風(fēng)險(xiǎn)最小，且沒有受到任何利誘或恐嚇等不當(dāng)行為影響的前提下，

自愿自主的捐贈(zèng)個(gè)人生物樣本及其關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，并與采集者/收集者共同簽署的文件，包括

但不限于合適條件下潛在研究應(yīng)用、研究成果潛在的商業(yè)應(yīng)用及其他問(wèn)題所適用的內(nèi)容。

注：知情同意書由采集者/收集者和被收集者共同簽署，一式兩份。正本由采集者/

收集者保存，被收集者保存副本。倫理要求與隱私保護(hù)見GB/T38736-2020第3.7條。

3.9腫瘤細(xì)胞存活率tumorcellvitalityrate

能夠增殖、保持代謝活性以及形成腫瘤類器官的細(xì)胞比例。

3.10環(huán)境污染environmentalcontamination

從環(huán)境或其他細(xì)胞中引入多余的化學(xué)或生物物質(zhì)。

[來(lái)源：WS233—2017]

3.11無(wú)菌技術(shù)aseptictechnology

在實(shí)驗(yàn)室，用于防止細(xì)胞、試劑、物料、人員受到微生物感染的操作。

[來(lái)源：WS233—2017]

3.12腫瘤細(xì)胞純度tumorcellpurity

具有相同生物學(xué)特性(如腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物、遺傳多態(tài)性及生物學(xué)活性等)的胃腫

瘤類器官中腫瘤細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。

3.13生長(zhǎng)因子growthfactors

促進(jìn)特定細(xì)胞類型或譜系增殖和/或分化的重組細(xì)胞因子。某些生長(zhǎng)因子可用于體

內(nèi)（例如，造血祖細(xì)胞的動(dòng)員）或離體（例如，細(xì)胞擴(kuò)增、疫苗開發(fā)和過(guò)繼性細(xì)胞療法）

2

情況下。

4．通則

4.1胃腫瘤組織采集與處理應(yīng)獲得倫理委員會(huì)審批。

4.2胃腫瘤組織采集前應(yīng)簽署知情同意書，應(yīng)在充分告知和尊重提供者權(quán)利的前提

下簽署知情同意書。

4.3胃腫瘤組織的處理宜采用可操作性強(qiáng)、成功率高、結(jié)果穩(wěn)定的方法。

4.4胃腫瘤組織采集與處理應(yīng)由接受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員/工作人員進(jìn)行。

5．基本原則

5.1簽署知情同意

應(yīng)在樣本采集前獲得類器官組織源供者的書面知情同意，明確供者和樣本收集方雙

方的利益和責(zé)任，知情同意應(yīng)符合GB/T38736—2020中5.3的要求。

5.2倫理要求

胃腫瘤類器官的構(gòu)建和研究方案應(yīng)由倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)。

5.3隱私保護(hù)

類器官組織源供者享有個(gè)人隱私權(quán)，其個(gè)人隱私信息的保密和保護(hù)應(yīng)符合GB/T

38736—2020中6的要求。

6.操作流程與方法

6.1胃腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶類器官的構(gòu)建

6.1.1胃腫瘤原發(fā)灶類器官的構(gòu)建

6.1.1.1胃腫瘤組織的獲取和運(yùn)送

手術(shù)獲取胃腫瘤組織，體積至少10mm×10mm×10mm。新鮮胃腫瘤組織應(yīng)在離體

30min內(nèi)放進(jìn)預(yù)冷的組織運(yùn)輸保存液，在4℃恒溫的低溫條件下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。對(duì)運(yùn)輸

過(guò)程的記錄應(yīng)符合GB/T37864—2019中A.3、B.3條，宜記錄的內(nèi)容包括但不限于運(yùn)送

方式、運(yùn)送過(guò)程中的溫度、接收時(shí)溫度或溫度范圍、運(yùn)送起止時(shí)間和日期。

6.1.1.2胃腫瘤組織的處理

6.1.1.2.1胃腫瘤組織的清洗

在超凈臺(tái)中將胃腫瘤組織取出，用預(yù)冷的含抗生素的PBS緩沖液振蕩漂洗3次（超

凈臺(tái)內(nèi)手動(dòng)搖晃100mm2培養(yǎng)皿10s）。

6.1.1.2.2胃腫瘤組織的分離和消化

用手術(shù)刀片及眼科剪將漂洗后的胃腫瘤組織機(jī)械解離成0.3mm3大小的組織塊，加

3

入37℃預(yù)熱的胃腫瘤組織消化液（應(yīng)加入合適的膠原酶，推薦Ⅳ型膠原酶或者Ⅺ型膠原

酶、透明質(zhì)酸酶以及Ⅱ型分散酶的混合液）。置于37℃振蕩水浴鍋中消化30-45min，加

入等體積的終止液終止消化，利用移液槍吹打100次，冰上靜置10min。

6.1.1.2.3細(xì)胞的過(guò)濾

通過(guò)70μm的篩網(wǎng)去除胞外基質(zhì)雜質(zhì)后離心（4?C，300×g，5min）。

6.1.1.2.4胃腫瘤原發(fā)灶類器官培養(yǎng)

棄掉上清，收集上清液至指定容器中，集中進(jìn)行生物無(wú)害化處理。向人胃腫瘤原發(fā)

灶的單細(xì)胞沉淀中加入適量培養(yǎng)基質(zhì)并輕輕重懸細(xì)胞，避免產(chǎn)生氣泡，按照50μL/孔向

24孔板中加入培養(yǎng)基質(zhì)-細(xì)胞混合物。37℃孵箱放置10min。待培養(yǎng)基質(zhì)凝固后，補(bǔ)充培

養(yǎng)基500μL/孔（提前37℃預(yù)熱）。每三天更換一次生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每代胃腫瘤類器官生長(zhǎng)

周期約為7-14天。

6.1.2胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶類器官的構(gòu)建

6.1.2.1胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織的獲取和運(yùn)送

手術(shù)獲取完整/部分胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織，體積至少5mm×5mm×5mm。新鮮胃腫

瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織應(yīng)在離體30min內(nèi)放進(jìn)預(yù)冷的組織運(yùn)輸保存液，在4℃恒溫的低溫條

件下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。對(duì)運(yùn)輸過(guò)程的記錄應(yīng)符合GB/T37864—2019中A.3、B.3條，宜記

錄的內(nèi)容包括但不限于運(yùn)送方式、運(yùn)送過(guò)程中的溫度，接收時(shí)溫度或溫度范圍、運(yùn)送起

止時(shí)間和日期。

6.1.2.2胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織的處理

6.1.2.2.1胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織的清洗

在超凈臺(tái)中將胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織取出，用預(yù)冷的含抗生素的PBS緩沖液振蕩

漂洗3次（超凈臺(tái)內(nèi)手動(dòng)搖晃100mm2培養(yǎng)皿10s）。

6.1.2.2.2胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織的分離和消化

用手術(shù)刀片及眼科剪去除非腫瘤組織后，將漂洗后的胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶機(jī)械解離成

0.3mm3大小的組織塊，加入37℃預(yù)熱的胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織消化液（根據(jù)轉(zhuǎn)移灶位

置選擇合適的消化酶，如卵巢實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶推薦使用Ⅱ型膠原酶和Ⅳ型膠原酶；肺實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)

移灶推薦使用去氧核糖核酸酶、Ⅰ型膠原酶以及Ⅱ型分散酶；肝實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶推薦使用Ⅳ型

膠原酶、Ⅱ型膠原酶以及Ⅱ型分散酶），37?C水浴振蕩消化60-90min，加入等體積的終止

液終止消化，利用移液槍吹打100-150次，冰上靜置10min。

4

6.1.2.2.3細(xì)胞的過(guò)濾

通過(guò)70μm的篩網(wǎng)去除胞外基質(zhì)雜質(zhì)后離心（4?C，300×g，5min）。

6.1.2.2.4胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶類器官培養(yǎng)

棄掉上清，收集上清液至指定容器中，集中進(jìn)行生物無(wú)害化處理。向人胃腫瘤實(shí)質(zhì)

轉(zhuǎn)移灶的單細(xì)胞沉淀中加入適量培養(yǎng)基質(zhì)輕輕重懸細(xì)胞，避免產(chǎn)生氣泡，按照50μL/孔

向24孔板中加入培養(yǎng)基質(zhì)-細(xì)胞混合物。37℃孵箱放置10min。待培養(yǎng)基質(zhì)凝固后，補(bǔ)

充培養(yǎng)基500μL/孔（提前37℃預(yù)熱）。每三天更換一次生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每代胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)

移灶類器官生長(zhǎng)周期約為7-14天。

6.1.3胃腫瘤非實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶類器官的構(gòu)建

6.1.3.1胃腫瘤非實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶的獲取和運(yùn)送

手術(shù)前獲取胃腫瘤非實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶，抽取患者腹水至少20mL。新鮮胃腫瘤腹水應(yīng)在

離體30min內(nèi)放入無(wú)菌離心管，在4℃恒溫的低溫條件下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。對(duì)運(yùn)輸過(guò)程的

記錄應(yīng)符合GB/T37864—2019中A.3、B.3條，宜記錄的內(nèi)容包括但不限于運(yùn)送方式、

運(yùn)送過(guò)程中的溫度、接收時(shí)溫度或溫度范圍、運(yùn)送起止時(shí)間和日期。

6.1.3.2胃腫瘤非實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶的處理

6.1.3.2.1細(xì)胞的過(guò)濾

在超凈臺(tái)中取出患者腹水，利用70μm篩網(wǎng)過(guò)濾去除腹水中可能含有的絮狀物、胞

外基質(zhì)雜質(zhì)，離心（4?C，200×g，5min）。收集腹水上清液至指定容器中，集中進(jìn)行生物

無(wú)害化處理。

6.1.3.2.2腫瘤細(xì)胞的提取和分離

棄掉上清，收集上清液至指定容器中，集中進(jìn)行生物無(wú)害化處理。利用預(yù)冷的PBS

緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，按合適的比例（推薦比例為1:3）加入紅細(xì)胞裂解液，在冰上裂

解8-12min后，離心（4?C，200×g，5min）。重復(fù)該步驟2-3次，至細(xì)胞沉淀中無(wú)肉眼可

見的血紅色。

6.1.3.2.3腫瘤細(xì)胞活性及數(shù)量檢測(cè)

采用吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）熒光染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，將離心后的細(xì)胞沉淀

用PBS緩沖液重懸，吹打混勻后吸取10μL細(xì)胞懸液置于0.5mL的EP（eppendorf）管

中加入10μL的AO/PI染液充分混勻，取20μL細(xì)胞懸液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，利用自動(dòng)細(xì)

胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量及活率。細(xì)胞總數(shù)達(dá)1×106個(gè)以上，細(xì)胞活率達(dá)90%以上可用于

5

類器官培養(yǎng)。

6.1.3.2.4胃腫瘤非實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶類器官培養(yǎng)

將重懸后的腫瘤細(xì)胞懸液離心（4?C，200×g，5min）。棄掉上清，收集上清液至指定

容器中，集中進(jìn)行生物無(wú)害化處理。向人胃腫瘤腹水單細(xì)胞沉淀中加入適量3D培養(yǎng)基

質(zhì)輕輕重懸細(xì)胞，避免產(chǎn)生氣泡，按照50μL/孔向24孔板中加入培養(yǎng)基質(zhì)-細(xì)胞混合物。

37℃孵箱放置10min。待培養(yǎng)基質(zhì)凝固后，補(bǔ)充培養(yǎng)基500μL/孔（提前37℃預(yù)熱）。每

三天更換一次生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每代胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶類器官生長(zhǎng)周期約為7-14天。

6.1.4保留胃腫瘤微環(huán)境類器官的構(gòu)建

6.1.4.1胃腫瘤組織的獲取和運(yùn)送

手術(shù)獲取完整/部分胃腫組織（原發(fā)灶或者實(shí)體轉(zhuǎn)移灶），體積至少5mm×5mm×5mm。

新鮮胃腫瘤組織應(yīng)在離體30min內(nèi)放進(jìn)預(yù)冷的組織運(yùn)輸保存液，在4℃恒溫的低溫條件

下運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。對(duì)運(yùn)輸過(guò)程的記錄應(yīng)符合GB/T37864—2019中A.3、B.3條，宜記錄

的內(nèi)容包括但不限于運(yùn)送方式、運(yùn)送過(guò)程中的溫度，接收時(shí)溫度或溫度范圍、運(yùn)送起止

時(shí)間和日期。

6.1.4.23D支撐材料的準(zhǔn)備

6.1.4.2.13D膠原溶液的配置

利用無(wú)菌水配置含有氫氧化鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液及碳酸氫鈉的無(wú)菌混合

溶液B、均勻混合Ⅰ型膠原、Ham’sF-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、混合液B（推薦按8：1：1的比例）

配置3D膠原溶液。操作過(guò)程應(yīng)避免氣泡產(chǎn)生，4℃保存。

6.1.4.2.2內(nèi)部類器官培養(yǎng)小室的制作

在30mm插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1mL3D膠原溶液，于37℃下靜置半小時(shí)，待其

凝固。

6.1.4.3胃腫瘤組織的處理

6.1.4.3.1胃腫瘤組織的清洗

在超凈臺(tái)中將胃腫瘤組織取出，用預(yù)冷的含抗生素的PBS緩沖液振蕩漂洗3次（超

凈臺(tái)內(nèi)手動(dòng)搖晃100mm2培養(yǎng)皿10s）。

6.1.4.3.2胃腫瘤組織的分離

用手術(shù)刀片及眼科剪去除非腫瘤組織后，將漂洗后的胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶機(jī)械解離成

0.3mm3大小的組織碎塊，加入1mL3D培養(yǎng)基質(zhì)輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，向培養(yǎng)小室

中加入培養(yǎng)基質(zhì)-組織混合物。于37℃孵箱中放置30min。待培養(yǎng)基質(zhì)凝固后，補(bǔ)充培養(yǎng)

6

基2mL/孔（提前37℃預(yù)熱）。每7天更換一次生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每代保留腫瘤微環(huán)境的胃腫

瘤類器官生長(zhǎng)周期約為14-30天。

圖1人胃腫瘤類器官構(gòu)建流程圖

6.1.5腫瘤類器官的傳代與保藏

6.1.5.1類器官傳代

應(yīng)選擇合適的類器官進(jìn)行科學(xué)試驗(yàn)或傳代，飽滿度達(dá)到80%左右，顯微鏡10×下可

看到超過(guò)20個(gè)類器官，或者大小200-400μm的類器官。胃腫瘤類器官構(gòu)建過(guò)程中，培

養(yǎng)傳代一般以1:3的比例進(jìn)行。吸去原培養(yǎng)基，每孔加入500μL的DPBS，利用1ml的

去尖槍頭破壞培養(yǎng)基質(zhì)，收集至15mL離心管后離心（4℃，150×g，5min），棄掉上清，

收集上清液至指定容器中，集中進(jìn)行生物無(wú)害化處理。加入適量TryplE后，置于37℃

水浴鍋消化5-8min后加入等體積的終止液終止消化，利用移液管吹打30-50次后離心

（4℃，300×g，5min）。棄掉上清，收集上清液至指定容器中，集中進(jìn)行生物無(wú)害化處

理。向細(xì)胞沉淀中加入適量3D培養(yǎng)基質(zhì)輕輕重懸細(xì)胞，避免產(chǎn)生氣泡，按照50μL/孔

向24孔板中加入培養(yǎng)基質(zhì)-細(xì)胞混合物。37℃孵箱放置10min。待培養(yǎng)基質(zhì)凝固后，補(bǔ)

充培養(yǎng)基500μL/孔（提前37℃預(yù)熱）。每三天更換一次生長(zhǎng)培養(yǎng)基。胃腫瘤類器官構(gòu)建

過(guò)程中，培養(yǎng)傳代簡(jiǎn)化流程見圖2。

7

圖2胃腫瘤類器官傳代簡(jiǎn)化流程

6.1.5.2類器官凍存

暫不使用的類器官應(yīng)按附錄A處理，加入細(xì)胞凍存液后移入低溫環(huán)境凍存。

6.1.5.3類器官的復(fù)蘇

類器官?gòu)?fù)蘇遵循速融原則。使用37℃水浴令其盡快融化，加入提前預(yù)熱的復(fù)蘇培養(yǎng)

基（推薦使用含10%FBS、抗生素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、谷氨酰胺、Y27632、

NAC的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基），1ml的去尖槍頭輕輕吹打混勻，離心（4℃，120×g,

5min）后加入適量培養(yǎng)基質(zhì)重懸，避免產(chǎn)生氣泡，24孔板按照45μL/孔。37℃孵箱放置

10min。待培養(yǎng)基質(zhì)凝固后，補(bǔ)充培養(yǎng)基500uL/孔（提前37℃預(yù)熱）。每三天更換一次生

長(zhǎng)培養(yǎng)基。

6.2操作注意事項(xiàng)

樣本采集、運(yùn)送、處理以及類器官的構(gòu)建、傳代、凍存、復(fù)蘇等過(guò)程均應(yīng)無(wú)菌操作，

以免污染。宜符合GB/T42060—2022中附錄A要求，注意保持手部衛(wèi)生的時(shí)間點(diǎn)包括

但不限于接觸患者前/后、無(wú)菌操作前、體液暴露后、接觸試驗(yàn)環(huán)境后、試驗(yàn)結(jié)束后。

8

7．類器官鑒定與質(zhì)量控制

編號(hào)檢測(cè)指標(biāo)指標(biāo)描述強(qiáng)制/檢測(cè)方法

推薦檢測(cè)

7.1形態(tài)光學(xué)顯微鏡下觀察人胃腫瘤強(qiáng)制按照附錄D檢測(cè)。

類器官，其形態(tài)通常呈現(xiàn)為囊參考文獻(xiàn)[3]

狀，且有多層細(xì)胞形態(tài)。部分

人胃腫瘤類器官呈現(xiàn)為實(shí)心

球狀或致密球體囊狀。

7.2體外可培養(yǎng)從捐獻(xiàn)者獲得的人胃腫瘤組強(qiáng)制顯微鏡觀察，消化

織，通過(guò)機(jī)械和消化酶聯(lián)用的后AO/PI熒光染

方法獲得單細(xì)胞懸液，3D培色檢測(cè)細(xì)胞活力

養(yǎng)方式生成胃腫瘤細(xì)胞類器與死亡狀態(tài)，H&E

官后，可以在體外維持長(zhǎng)期培染色和FFPE組織

養(yǎng)，且核型正常，傳代10代病理切片對(duì)比

以上。

7.3體外可重建當(dāng)類器官解離為5-20個(gè)細(xì)胞強(qiáng)制顯微鏡觀察。

左右的小團(tuán)塊后，仍能進(jìn)行體參考文獻(xiàn)[14]

外重建成為新的類器官，新培

養(yǎng)出的類器官與原來(lái)類器官

具有相同的形態(tài)、細(xì)胞組成、

細(xì)胞核型等特征。

7.4原代腫瘤細(xì)新復(fù)蘇的類器官存活率不低強(qiáng)制按照附錄D檢測(cè)。

胞存活率于70%。且存活的類器官在體

外可以進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)。

7.5染色體核型正常核型應(yīng)為46，XY或46，推薦按照附錄C檢測(cè)。

XX。

7.6標(biāo)志基因表增殖標(biāo)志物Ki67；胃腫瘤標(biāo)志強(qiáng)制基因表達(dá)按照附

達(dá)物CA19-9、CEA、CA72-4、錄E檢測(cè)。

CA50、CA24-2等。蛋白質(zhì)表達(dá)按照

9

附錄D.1.2檢測(cè)。

7.7微生物真菌、細(xì)菌、支原體、病毒等強(qiáng)制

應(yīng)為陰性。

7.8.1細(xì)菌及真菌真菌、細(xì)菌應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共

和國(guó)藥典（四部）》

中“1101無(wú)菌檢查

法”項(xiàng)檢測(cè)。

7.8.2支原體支原體應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共

和國(guó)藥典（四部）》

“3301支原體檢測(cè)

法”項(xiàng)檢測(cè)。

7.8.3外源病毒因外源病毒因子應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照《中華人民共

子和國(guó)藥典》中

“3302外源病毒因

子檢查法”項(xiàng)檢

測(cè)。

7.8.4HBVHBV應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照WS/T299—

2022核酸法檢測(cè)。

7.8.5HCVHCV應(yīng)為陰性。強(qiáng)制按照WS213—

2018核酸法檢驗(yàn)。

7.9STR體外培養(yǎng)的類器官，應(yīng)進(jìn)行推薦按照附錄B檢測(cè)。

STR檢測(cè)及分型鑒定，無(wú)樣品

間的交叉污染。受檢類器官

STR位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)與

其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（其原始

組織或衍生細(xì)胞系）STR基因

分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，兩者的匹

配度應(yīng)≥80%。

10

8.數(shù)據(jù)管理

宜結(jié)合類器官的使用目的，制訂數(shù)據(jù)管理規(guī)范，包括但不限于數(shù)據(jù)內(nèi)容及保存時(shí)

間、數(shù)據(jù)管理與使用的權(quán)限及責(zé)任。詳細(xì)的臨床樣本數(shù)據(jù)管理可參照國(guó)家藥品監(jiān)督管

理局頒布的《藥物臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GCP）中的數(shù)據(jù)管理部分內(nèi)容。

9.廢棄類器官處置

類器官構(gòu)建和傳代過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物處置應(yīng)符合國(guó)家或地方法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范要

求，符合WS233—2017中7.8條規(guī)定，對(duì)于不合格的或者污染的類器官細(xì)胞應(yīng)遵循法

律和實(shí)驗(yàn)室規(guī)定丟棄到指定地點(diǎn)，最終處置應(yīng)交由經(jīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)保部門資質(zhì)認(rèn)定的醫(yī)療廢物

處理單位集中處置。同時(shí)應(yīng)由專人進(jìn)行書面記錄，并存檔。

11

附錄A

（資料性）

胃腫瘤類器官培養(yǎng)用試劑材料與操作技術(shù)要點(diǎn)

A.1主要試劑材料

A.1.1培養(yǎng)基主要構(gòu)成

表A.1胃腫瘤類器官原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶類器官培養(yǎng)基的主要成份表

中文名稱英文名稱

基礎(chǔ)培養(yǎng)基AdvancedDMEM/F12

谷氨酰胺GlutaMAX

4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液HEPES

抗生素Primocin

N-乙酰半胱氨酸N-acetylcysteine

尼可酰胺Niacinamide

血清添加劑B27

血清添加劑N2

表皮生長(zhǎng)因子EGF

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10FGF10

胃泌素IGastrinI

Wnt-3a重組蛋白Wnt-3a

R-Spondin1重組蛋白R(shí)-Spondin1

頭蛋白Noggin

TGFβ抑制劑A83-01

ROCK抑制劑**Y-27632

*腫瘤類器官傳代培養(yǎng)可選不加或低濃度使用

A.1.2類器官培養(yǎng)3D支架材料

3D培養(yǎng)基質(zhì)提取自基底膜的基質(zhì)，主要由層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白、硫酸

肝素糖蛋白等組成，還包含生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等。培養(yǎng)基質(zhì)在室溫條件下聚合

形成具有生物學(xué)活性的三維支架，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能。

該結(jié)構(gòu)不僅有利于體外細(xì)胞的培養(yǎng)和分化，而且能夠?yàn)槲改[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支架。培

12

養(yǎng)基質(zhì)在零度以下低溫環(huán)境呈液態(tài)，故凡是涉及培養(yǎng)基質(zhì)的試驗(yàn)操作皆應(yīng)置冰盒操作。

A.1.3組織消化酶

胃腫瘤原發(fā)灶組織消化中涉及的消化酶主要有即Ⅳ型膠原酶、Ⅵ型膠原酶與Ⅱ型分

散酶。胃腫瘤實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移灶組織根據(jù)轉(zhuǎn)移灶位置選擇合適的消化酶，涉及的消化酶主要有

Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶去氧核糖核酸酶、Ⅱ型分散酶。以利于制備為單細(xì)

胞懸液。

A.1.4類器官凍存液

類器官凍存液為無(wú)血清凍存液，一般宜含有10%的二甲基亞砜(DMSO)。

A.2胃腫瘤類器官培養(yǎng)操作要點(diǎn)

A.2.1類器官污染的處置

胃腫瘤類器官培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)定期觀察、拍照，每3-4天更換一次類器官培養(yǎng)基。一

般在第3-4天于倒置顯微鏡下可以觀察到少量50-70μm的類器官小球，到第7-8天可觀

察到200-400μm的胃腫瘤類器官。定期觀察有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染。如果在培養(yǎng)3天內(nèi)

出現(xiàn)培養(yǎng)基質(zhì)渾濁，提示可能有霉菌和細(xì)菌污染，需及時(shí)采取丟棄處理。

A.2.2類器官培養(yǎng)物接種注意事項(xiàng)

將細(xì)胞懸液與培養(yǎng)基質(zhì)按照1:1混勻吹打，吹打過(guò)程中切忌產(chǎn)生大量氣泡，以免影

響后續(xù)培養(yǎng)物接種。24孔板可提前于37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱30min，以加速培養(yǎng)基質(zhì)的凝固。

A.2.3類器官傳代注意事項(xiàng)

胃腫瘤類器官可以連續(xù)傳代超過(guò)10代或持續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月以上。與類器官有關(guān)的試

驗(yàn)研究宜在連續(xù)傳代10代以內(nèi)或者持續(xù)培養(yǎng)6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行。

A.3類器官凍存注意事項(xiàng)

凍存前每孔加入500μL類器官收集液，將類器官吸至試管內(nèi)，按照50μL膠加500

μL類器官收集液，置于冰上60min，去除培養(yǎng)基質(zhì)，離心清洗后，加入細(xì)胞消化酶消化

3-5min，使其消化成單細(xì)胞懸液，離心獲取細(xì)胞沉淀后加入適量類器官凍存液混勻（1mL

左右），分裝于500μL低溫凍存管中，放入程序性凍存盒內(nèi)于-80℃深低溫冰箱過(guò)夜保存，

次日將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。

A.4類器官?gòu)?fù)蘇注意事項(xiàng)

從液氮罐中取出的類器官凍存管要快速放入37℃水浴鍋中使其盡快融化。吸出類

器官凍存物移至15mL無(wú)菌離心管中，再加入10倍體積的復(fù)蘇培養(yǎng)基混勻。之后操作

同前述的類器官傳代培養(yǎng)過(guò)程。

13

附錄B

（資料性）

短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測(cè)

STR檢測(cè)流程詳見圖B.1，先提取細(xì)胞DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，最后進(jìn)

行結(jié)果分析。

圖B.1STR檢測(cè)流程

人源類器官STR鑒定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：

受檢類器官STR位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系（其原始組織或衍生

細(xì)胞系）STR基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)：

B.1若兩者的匹配度≥80%，則判定受檢細(xì)胞系為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系或?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系的衍

生細(xì)胞系。

B.2若兩者的匹配度在56%-80%之間，建議結(jié)合細(xì)胞系形態(tài)、細(xì)胞系特異性標(biāo)記物

等輔助分析進(jìn)行綜合判斷。

B.3若兩者的匹配度≤56%，則判定受檢細(xì)胞樣本與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系不相關(guān)。

14

附錄C

（資料性）

染色體核型檢測(cè)

C.1試驗(yàn)當(dāng)天保證細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，一般一個(gè)6cm的培養(yǎng)皿細(xì)胞長(zhǎng)到80%的

密度能做一次試驗(yàn)。

C.2將待測(cè)細(xì)胞從37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中拿出，添加秋水仙素（終濃度為0.2μg/mL），

搖勻后37℃孵育1-2h。

C.3等待的同時(shí)，配制低滲溶液0.075MKCL(配制:8mL無(wú)菌水+44.7mgKCL)，放入

37℃水浴預(yù)熱。

孵育后的細(xì)胞用胰酶消化，1200r/min，離心5min，收集于離心管中，去除上清液，

用8mL低滲液重懸，打勻后放37℃水浴箱40min。

C.4加入新鮮配制的固定液（甲醇/冰乙酸=2/1-3/1）2mL混勻，室溫下放10min后，

1000r/min離心10min，去上清液（留500μL,先將底部細(xì)胞吹勻），新加入8mL固定液，

1200r/min，離心10min，重復(fù)三次后，滴片，放入80℃烘箱老化3h。

C.5再將烤干的玻片放入新鮮配制的胰酶（0.25%）中消化1min（嚴(yán)格控制時(shí)間）

后，再放入吉姆薩染液中染色5-10min（先用1片染5min,根據(jù)顏色調(diào)整后面的染色時(shí)

間），取出用流水沖去染液后，在顯微鏡下觀察結(jié)果。

15

附錄D

（資料性）

胃腫瘤類器官鑒定

D.1類器官形態(tài)學(xué)鑒定

D.1.1顯微鏡下培養(yǎng)形態(tài)評(píng)估

將胃腫瘤類器官培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下，在20倍視野下計(jì)數(shù)類器官數(shù)目。類器

官數(shù)目不少于60個(gè)/視野表明類器官生長(zhǎng)狀態(tài)良好。生長(zhǎng)活力好的類器官平均直徑約為

200-400μm。若個(gè)別類器官體積過(guò)大（可達(dá)600μm）則提示類器官趨向衰老，應(yīng)盡早傳

代，以防止衰老的類器官影響類器官傳代。

D.1.2腫瘤類器官的形態(tài)學(xué)及免疫標(biāo)記鑒定

胃腫瘤組織或者胃腫瘤類器官成功構(gòu)建后，通過(guò)制備冰凍切片或者石蠟包埋切片，

進(jìn)行蘇木素/伊紅染色（H&E）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，通過(guò)免疫熒光或者免疫組化染色進(jìn)行生

物標(biāo)志物檢測(cè)。增殖標(biāo)志物Ki67；胃腫瘤標(biāo)志物CA19-9、CEA、CA72-4、CA50、CA24-

2等。同時(shí)進(jìn)行類器官整體染色：培養(yǎng)大小約150-300um的類器官，加入類器官收集液，

置于冰上放置1h以溶解培養(yǎng)基質(zhì)，預(yù)冷PBS緩沖液漂洗類器官，低速離心（600r/min）

2次。加入0.125%TritonX-100破膜液，室溫作用10min，室溫PBS緩沖液漂洗3次后

封閉用血清（10%二抗血清）封閉1h。將類器官分別放置相應(yīng)染色組別的共聚焦小室

中，10%二抗血清作為配制一抗的稀釋液，根據(jù)不同稀釋比配制一抗抗體組合，滴加一

抗，4℃孵育過(guò)夜后PBS緩沖液漂洗3次。不同組別分別滴加各種熒光標(biāo)記的二抗，室

溫避光作用1h。緩沖液加入水性封片劑，避光濕盒保存，共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像

并三維重建類器官結(jié)構(gòu)。

D.2類器官存活率評(píng)估

D.2.1胃腫瘤組織消化

胃腫瘤組織酶解后獲得單細(xì)胞懸液，采用AO/PI熒光染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。將離心

后的細(xì)胞沉淀用AdvancedDMEM/F12培養(yǎng)基重懸，經(jīng)吹打均勻后吸取10μL置于0.5mL

的EP（eppendorf）管，向EP管中加入10μLAO/PI染液充分混勻，染色3min，取20

μL細(xì)胞懸液加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，利用自動(dòng)細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量及活率。

注：活細(xì)胞比率應(yīng)>90%可用于類器官細(xì)胞培養(yǎng)。

D.2.2類器官傳代及凍存復(fù)蘇

16

類器官傳代前、酶解為5-20個(gè)細(xì)胞的小細(xì)胞團(tuán)后以及類器官?gòu)?fù)蘇后，應(yīng)使用D.2.1

中方法進(jìn)行類器官存活率計(jì)算。如果要利用類器官進(jìn)行藥物篩選或者化合物安全性評(píng)價(jià)，

則使用商品化的CellTiter-Glo?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒對(duì)類器官的活力進(jìn)行檢測(cè)。

D.3胃腫瘤類器官遺傳特征分析

D.3.1使用基因測(cè)序儀對(duì)胃腫瘤類器官和相應(yīng)的原發(fā)腫瘤組織進(jìn)行全外顯子組測(cè)

序（WES），揭示胃腫瘤類器官的遺傳特征，或SNP/STR(單核苷酸多態(tài)/短串聯(lián)重復(fù))分

析所獲得的類器官可與原發(fā)腫瘤組織相匹配。確定所構(gòu)建的胃腫瘤類器官確實(shí)可以代表

患者腫瘤。

D.3.2通過(guò)批量DNA測(cè)序檢測(cè)胃腫瘤類器官的變異等位基因頻率，揭示腫瘤細(xì)胞

比例，確定胃腫瘤類器官的腫瘤純度。

D.3.3在類器官培養(yǎng)過(guò)程中，如果在形態(tài)上有區(qū)別，可以手動(dòng)將類器官?gòu)呐囵B(yǎng)物中

取出，或根據(jù)其密度或大小進(jìn)行分離，建議在分離后進(jìn)行檢查以確認(rèn)取出的類器官的身

份，例如，用定量PCR檢測(cè)組織特異性標(biāo)記或用DNA測(cè)序檢測(cè)突變的缺失。

17

附錄E

（資料性）

標(biāo)志基因檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

E.1腫瘤類器官樣本制備

體外培養(yǎng)的腫瘤類器官，吸掉培養(yǎng)基。加入等體積的PBS緩沖液（pH為7.4），吸

掉緩沖液。重復(fù)一次。

E.2腫瘤類器官RNA提取

E.2.1收集細(xì)胞：待腫瘤類器官長(zhǎng)到一定的數(shù)量后，將24孔板中的培養(yǎng)基去除，

加入1mL的PBS緩沖液進(jìn)行清洗1遍。去除PBS緩沖液后，加入1mL無(wú)動(dòng)物源性重

組胰酶，并用1mL量程的移液槍將培養(yǎng)基質(zhì)打散，以利于消化酶與類器官進(jìn)行充分的

接觸與消化。30min后，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中離心（300×g，5min），

收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清；

E.2.2裂解處理：輕彈離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散，加入適量裂解液RL（350μL），

旋渦振蕩；

E.2.3將所有溶液轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱CS上(過(guò)濾柱CS放在收集管中)，13,400×g離心

2min，收集濾液；

E.2.4向?yàn)V液中加入1倍體積70%乙醇（通常為350μL或600μL），混勻（此時(shí)可

能會(huì)出現(xiàn)沉淀），得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中（吸附柱CR3放入收集管

中），13,400×g離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.5向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，13,400×g離心30-60s，倒掉

收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.6DNaseI工作液的配制：取10μLDNaseI儲(chǔ)存液放入新的RNase-Free離心

管中，加入70μL去除DNA緩沖液RDD，輕柔混勻；

E.2.7向吸附柱CR3中央加入80μL的DNaseI工作液，室溫放置15min；

E.2.8向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，13,400×g離心30-60s，倒掉

收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.9向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW（按照說(shuō)明加入乙醇），室溫靜置

2min，13,400×g離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

E.2.10重復(fù)步驟2.9；

18

E.2.11離心（13,400×g，2min），收集上清液至指定容器中，集中進(jìn)行生物無(wú)害化處

理。將吸附柱CR3置于室溫放置至少2min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

E.2.12將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個(gè)新的RNase-Free離心管中，加入30-100μLRNase-

FreeddH2O，室溫放置2min，離心（13,400×g，2min），得到RNA溶