《儀器分析》第八章++液相色譜分析課件

液相色譜法了解液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)及適用范圍理解常用檢測(cè)器原理、優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍理解各種分離方式的原理、適用的分析對(duì)象及選擇原則理解超臨界流體色譜法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍《儀器分析》第八章++液相色譜分析HPLC與GC的區(qū)別：GC流動(dòng)相惰性，HPLC流動(dòng)相與組分有作用HPLC一般在室溫下進(jìn)行、GC多在高溫下進(jìn)行應(yīng)用范圍－全部色譜分離對(duì)象的20％GC，HPLC約占80％HPLC更適合于制備1）液體的擴(kuò)散系數(shù)比氣體的小倍左右；2）液體粘度比氣體約大100倍；3）液體表面張力比氣體大104倍；4）液體密度約大1000倍；5）液體比氣體不可壓縮?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析1固定相和流動(dòng)相（1）固定相按照承受壓力來分：

剛性固體－硅膠，耐高壓，表面可鍵合各種功能團(tuán)

硬膠－聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成，承壓能力低，主要用于離子交換和尺寸排阻色譜《儀器分析》第八章++液相色譜分析按照孔隙深度來分：

表面多孔型－實(shí)心玻璃外面覆蓋一層多孔活性物質(zhì)，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑和聚酰胺等，厚度1－2

m，以形成無數(shù)向外開放的淺孔。

全多孔微粒型－由直徑為10-3數(shù)量級(jí)的硅膠微粒凝聚而成，顆粒細(xì)，孔淺，相對(duì)死體積小，出峰快，柱效高，但需要更高的操作壓力。最大允許進(jìn)樣量比表面多孔型大5倍《儀器分析》第八章++液相色譜分析（2）流動(dòng)相純度高粘度低化學(xué)穩(wěn)定性好沸點(diǎn)高于55oC

溶劑要完全浸潤(rùn)固定相與檢測(cè)器匹配《儀器分析》第八章++液相色譜分析2高效液相色譜儀1）儲(chǔ)液器；2）脫氣器；3）高壓泵；4）進(jìn)樣器；5）色譜柱；6）檢測(cè)器?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析

主要部件：儲(chǔ)液器－耐腐蝕、配2m鎳合金過濾器脫氣裝置－氦氣鼓泡來驅(qū)除溶在溶劑中的氣體高壓泵輸送流動(dòng)相，壓力幾Mpa至數(shù)十MPa。無脈動(dòng)或者脈動(dòng)很小流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕、密封性好恒壓泵：壓力恒定，泵腔體積大，流量隨外界阻力改變而改變，逐漸被恒流泵取代

氣動(dòng)放大泵恒流泵：流量恒定

往復(fù)活塞泵、螺旋傳動(dòng)注射泵《儀器分析》第八章++液相色譜分析梯度洗脫裝置類似于氣相色譜中的程序升溫兩種、三種或者四種溶劑按照比例進(jìn)行混合，進(jìn)行二元、三元、四元梯度淋洗優(yōu)點(diǎn)：改善峰形、提高柱效、分析時(shí)間減少；缺點(diǎn)：更換流動(dòng)相達(dá)到平衡的時(shí)間需要更長(zhǎng)常采用低壓梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。或者：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析進(jìn)樣器高壓進(jìn)樣閥－用微量注射器將樣品注入樣品環(huán)管（10L到2mL）《儀器分析》第八章++液相色譜分析色譜柱色譜系統(tǒng)的心臟優(yōu)質(zhì)不銹鋼管，內(nèi)壁光潔平滑接頭死體積盡可能小為了保護(hù)色譜柱不被污染，有時(shí)候需要在分析柱前加一根短柱，稱為衛(wèi)柱。為了防止由于衛(wèi)柱而過分增加壓力，在衛(wèi)柱中使用的顆粒大小約10－30m。柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長(zhǎng)5～40cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析檢測(cè)器紫外檢測(cè)器

70％應(yīng)用，氘燈，適用于梯度淋洗對(duì)流動(dòng)相速度變化不敏感溶劑選擇時(shí)紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)不能小于溶劑的紫外截至波長(zhǎng)；《儀器分析》第八章++液相色譜分析

紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展：光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。《儀器分析》第八章++液相色譜分析熒光檢測(cè)器－靈敏度比紫外高2個(gè)數(shù)量級(jí)

高靈敏度、高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；《儀器分析》第八章++液相色譜分析示差折光檢測(cè)器通用型，靈敏度低，溫度影響大，不能用于梯度淋洗；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；《儀器分析》第八章++液相色譜分析電化學(xué)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器、庫侖檢測(cè)器、伏安檢測(cè)器以及安培檢測(cè)器。電導(dǎo)檢測(cè)器只用于離子色譜。安培型最常用，靈敏度高，選擇性好?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析紫外吸收示差折光熒光安培類型選擇性通用性選擇性選擇性線性范圍2.4

104104～103104最小檢測(cè)量ng0.1~1102

～10310-3

～10-20.01~1梯度淋洗能不能能不能流速敏感性不敏感不敏感不敏感敏感溫度敏感性低敏感低敏感HPLC檢測(cè)器性能比較《儀器分析》第八章++液相色譜分析3液-固色譜法（1）原理吸附能力大小

與吸附劑比表面積、物理化學(xué)性質(zhì)、組分分子結(jié)構(gòu)、流動(dòng)相性質(zhì)有關(guān)。組分、溶劑競(jìng)爭(zhēng)吸附活性中心分離非離子型、不溶于水的幾何異構(gòu)體

非極性石油烴的組成分析、芳香異構(gòu)體等《儀器分析》第八章++液相色譜分析（2）固定相常用的是表面多孔和全多孔微粒型硅膠、氧化鋁等。一般采用5-10m全多孔微粒?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析（3）流動(dòng)相極性大的組分選擇極性強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的選擇極性弱的流動(dòng)相。對(duì)于給定的吸附劑，溶劑強(qiáng)度用溶劑強(qiáng)度參數(shù)

表示，即單位面積吸附劑表面的溶劑吸附能。

越大，溶劑極性越大。保留值主要取決于官能團(tuán)類型和數(shù)目。各類物質(zhì)的保留值順序：飽和烴<烯烴<芳烴有機(jī)鹵化物<硫化物<醚<硝基化合物<腈<酯醛酮<醇胺<酰胺<羧酸<磺酸《儀器分析》第八章++液相色譜分析4化學(xué)鍵合相色譜法（1）化學(xué)鍵合相

硅膠表面的硅羥基，能與合適的化合物反應(yīng)。1）消除或者掩蓋了表面吸附活性點(diǎn)，使表面性質(zhì)均勻，緩和不可逆吸附，提高峰對(duì)稱性。2）耐溶劑沖洗，沒有固定液流失。3）改變鍵合的有機(jī)分子的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)類型，能改變固定相的分離選擇性。4）固定液穩(wěn)定性高，配用高靈敏度檢測(cè)器，可以降低最低檢出量?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析鍵合反應(yīng)類型：1.Si-O-C鍵型（硅膠和醇類的反應(yīng)）

發(fā)展初期使用的，在有水、醇存在下，有水解和醇解的可能，只能在正相條件下使用。

2.Si-N-C、Si-C鍵型（鹵化硅膠和胺類的反應(yīng)）熱和化學(xué)穩(wěn)定性比酯型好。從理論上講，這種結(jié)構(gòu)具有更好的穩(wěn)定性，特別是對(duì)于微堿性流動(dòng)相，而且R基可以多次氯化，形成聚烷基鍵合相，但是制備困難。《儀器分析》第八章++液相色譜分析3.Si-O-Si-C鍵型（硅膠和有機(jī)硅烷的反應(yīng)）目前用得最多的類型。具有良好的熱合化學(xué)穩(wěn)定性，能夠在pH2~8.5的介質(zhì)中使用?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析（2）正相鍵合相色譜流動(dòng)相極性小于固定相，常常是混合溶劑，由非極性溶劑與極性溶劑混合而成，極性增大，保留值降低。適合于分離中等極性的化合物，如脂溶性維生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有機(jī)氯農(nóng)藥等。《儀器分析》第八章++液相色譜分析影響反相鍵合相色譜保留值的因素：碳鏈長(zhǎng)度。碳的負(fù)載量和表面覆蓋率。載體孔徑尺寸與純度殘余硅醇基數(shù)目（3）反相鍵合相色譜

C18和C8最常用，流動(dòng)相為極性溶劑。極性大的組分先流出，極性小的后流出。《儀器分析》第八章++液相色譜分析反相色譜流動(dòng)相

水和與水混溶的有機(jī)溶劑混合組成。溶劑強(qiáng)度可以調(diào)節(jié)，極性越大，洗脫能力越小。反相色譜受到最廣泛應(yīng)用的原因：在水中可以加入各種添加劑，改變流動(dòng)相的離子強(qiáng)度、pH和極性等，以提高選擇性。而且水的截止波長(zhǎng)低，有利于痕量組分的檢測(cè)。反相鍵合相穩(wěn)定，不易被強(qiáng)極性組分污染。利用二次化學(xué)平衡，可以使不能直接用反相色譜分離的組分用反相色譜分離。《儀器分析》第八章++液相色譜分析反相色譜中的離子抑制法分離水溶液中可解離的弱酸弱堿時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH來抑制解離，使分離改進(jìn)的方法。流動(dòng)相的pH應(yīng)調(diào)節(jié)至比組分的pKa大（堿）或小（酸）兩個(gè)單位以上。當(dāng)弱酸的pKa在3

pKa

7之間、弱堿的pKa在7

pKa

8之間可采用離子抑制法。對(duì)于pKa<3的酸或者pKa>8的堿，可以采取離子對(duì)色譜法。《儀器分析》第八章++液相色譜分析離子對(duì)色譜離子對(duì)提取技術(shù)與色譜的結(jié)合。強(qiáng)極性電離型化合物在反相色譜體系中保留值很低，接近死時(shí)間流出來，直接用RP-HPLC分離困難。而離子交換色譜不能夠同時(shí)分離離子型和非離子型樣品，而且柱效不高。為了分離離子性化合物，Schill等將離子對(duì)萃取原理引入高效液相色譜，形成離子對(duì)色譜，又稱為離子對(duì)分配色譜?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析

它是在色譜體系中加入一種與樣品離子電荷相反的離子對(duì)試劑，通常稱為對(duì)離子（counterion）。由于形成離子對(duì)、動(dòng)態(tài)離子交換或者離子相互作用等第二種化學(xué)平衡，從而改變了樣品離子在兩相中的分配，使離子性溶質(zhì)保留行為和分離選擇性發(fā)生顯著變化。

色譜系統(tǒng)中有機(jī)溶劑通過溶劑化使親脂性離子對(duì)穩(wěn)定性提高：《儀器分析》第八章++液相色譜分析影響離子對(duì)色譜保留值的因素：pH。離子對(duì)試劑的性質(zhì)和濃度。溶劑化作用。離子強(qiáng)度和金屬離子影響。隨著離子強(qiáng)度的增加，離子對(duì)的保留值下降，而中性溶質(zhì)的保留值趨于上升。溫度?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析5離子交換色譜法（1）原理

離子交換色譜通過固定相表面帶電荷的基團(tuán)與樣品離子以及流動(dòng)相離子進(jìn)行可逆交換、離子-偶極作用或吸附，實(shí)現(xiàn)色譜分離。不同組分離子對(duì)固定離子基團(tuán)親和力差別實(shí)現(xiàn)分離。檸檬酸根>SO42->C2O42->I->HSO4->NO3->CrO42->Br->SCN->Cl->HCOO->CH3COO->OH->F-Fe3+>Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>UO22+>Tl+>Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>H+>Li+《儀器分析》第八章++液相色譜分析（2）固定相

通常稱為離子交換劑或者離子交換填料。根據(jù)交換劑的性質(zhì)，有用于交換陽離子的陽離子交換劑和交換陰離子的陰離子交換劑。根據(jù)交換基團(tuán)不同，分為強(qiáng)酸性陽離子、弱酸性陽離子、強(qiáng)堿性陰離子、弱堿性陰離子。離子交換樹脂應(yīng)用最廣泛的離子交換樹脂是苯乙烯型，它是在苯乙烯樹脂上引入離子交換基團(tuán)。硅膠化學(xué)鍵合離子交換劑為了克服離子交換劑樹脂溶漲和被壓縮的缺點(diǎn)，制備了各種硅膠鍵合離子交換劑?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析（3）流動(dòng)相鹽類緩沖溶液，影響保留值的因素：

pH

緩沖劑類型（淋洗離子電荷）離子強(qiáng)度有機(jī)溶劑添加劑配位劑：配體交換反應(yīng)RM-L+X<——>RM-X+L《儀器分析》第八章++液相色譜分析（4）離子色譜法

電導(dǎo)檢測(cè)器是離子交換色譜常用的檢測(cè)器，然而，離子交換色譜淋洗液很多是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)比待測(cè)溶質(zhì)高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，完全掩蓋了待測(cè)離子信號(hào)。大多數(shù)無機(jī)離子沒有紫外吸收，檢測(cè)困難是妨礙離子交換色譜發(fā)展和應(yīng)用的重要原因之一。1975年，Small等提出的離子色譜很好解決了這個(gè)問題?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析雙柱離子色譜（抑制離子色譜）分離柱采用低容量交換劑，交換柱上分離機(jī)理和離子交換色譜相同。抑制柱反應(yīng)是構(gòu)成離子色譜高靈敏度個(gè)高選擇性的重要基礎(chǔ)。分離陽離子，一般用無機(jī)酸做淋洗劑，強(qiáng)堿性高容量陰離子交換劑做抑制柱，在抑制柱內(nèi)產(chǎn)生兩個(gè)重要反應(yīng)：R+OH-+H+Cl-<---->R+Cl-+H2OR+OH-+M+Cl-<---->R+Cl-+M+OH-

流動(dòng)相的無機(jī)酸與抑制柱反應(yīng)生成水而除去，待測(cè)陽離子由鹽轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿。抑制反應(yīng)的結(jié)果不僅降低了淋洗液電導(dǎo)，而且由于OH-的離子淌度是Cl-的2.6倍，同時(shí)提高了檢測(cè)陽離子的靈敏度?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析

分離陰離子，一般用NaOH或者NaHCO3做淋洗劑，強(qiáng)酸性高容量陽離子交換劑做抑制柱，在抑制柱內(nèi)產(chǎn)生兩個(gè)重要反應(yīng)：R-H++Na+OH-<---->R-Na++H2OR-H++Na+X-<---->R-Na++H+X-

淋洗液在抑制柱上反應(yīng)，淋洗離子變成水或者碳酸（NaHCO3時(shí)），使本底電導(dǎo)大大降低。樣品離子轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酸，而且由于H+的離子淌度是Na+的7倍，同時(shí)提高了檢測(cè)陰離子的靈敏度。由于抑制柱積累了來自流動(dòng)相的Na+

或Cl-離子，逐漸喪失抑制能力，必須經(jīng)常用酸或堿再生。《儀器分析》第八章++液相色譜分析膜離子抑制器抑制柱必須再生，壽命短。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，采用具有磺酸基或季胺基團(tuán)的聚苯乙烯多孔纖維制成的離子交換膜管，管內(nèi)流過洗脫液，管外流過離子交換再生液?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析6尺寸排阻色譜法（1）原理

按照分子尺寸的差異進(jìn)行分離的一種液相色譜方法，也稱為凝膠色譜法。以水溶液為流動(dòng)相稱凝膠過濾色譜（GFC），有機(jī)溶劑為流動(dòng)相稱為凝膠滲透色譜（GPC）。VsVGVm《儀器分析》第八章++液相色譜分析凝膠色譜柱床的體積分布凝膠色譜柱床總體積VA包括填料骨架體積VG，填料孔穴體積VS和顆粒間體積Vm：VA=VG+VS+VmVT=VS+Vm固定相－凝膠色譜填料孔穴中VS的溶劑流動(dòng)相－填料顆粒間的體積Vm

中的溶劑溶劑分子能夠擴(kuò)散進(jìn)入填料孔穴。如果溶質(zhì)分子足夠小，也可以不同程度地向孔穴內(nèi)擴(kuò)散，占據(jù)一部分孔穴體積；如果溶質(zhì)分子體積足夠大，則不能擴(kuò)散進(jìn)入孔穴，被最先流出?！秲x器分析》第八章++液相色譜分析Ve=Vm+VSa式中Ve是淋洗體積，即溶質(zhì)保留體積，VSa是一定分子大小的溶質(zhì)滲進(jìn)孔穴所占的體積，是VS的一部分，是溶質(zhì)分子量的函數(shù)。VSa和VS之比定義為分配系數(shù)KGPC：《儀器分析》第八章++液相色譜分析相對(duì)分子量校準(zhǔn)曲線以相對(duì)分子量對(duì)保留體積作圖。A排除極限B全滲透極限《儀器分析》第八章++液相色譜分析（2）固定相

常用的有無機(jī)和有機(jī)兩類，5-10m。。多孔玻璃或硅膠：平衡快，耐高溫，制造容易，孔徑4-250nm。易產(chǎn)生吸附效應(yīng)，需硅烷化處理。苯乙烯二乙烯基苯共聚物：孔徑由交聯(lián)劑二乙烯基苯的量來控制，疏水性，流動(dòng)相必須是非水溶劑。在交聯(lián)劑中引入親水基團(tuán)，如磺化二乙烯基苯等，可以得到親水的共聚物。《儀器分析》第八章++液相色譜分析

孔徑大小是非常重要的參數(shù)，它表明可分離的相對(duì)分子量的范圍。《儀器分析》第八章++液相色譜分析（3）流動(dòng)相

要求：能溶解樣品，沸點(diǎn)比柱溫高25-50C，粘度低，與樣品折光率相差大。常用四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺、水等。尺寸排阻色譜主要應(yīng)用：分離蛋白質(zhì)、核酸等測(cè)定高聚物的相對(duì)分子量分布研究聚合機(jī)理《儀器分析》第八章++液相色譜分析7分離模式選擇與應(yīng)用

從分子量、水溶性、極性和分子結(jié)構(gòu)出發(fā)進(jìn)行選擇。樣品分子量<2000分子量>2000水溶性非水溶性離子型離子交換色譜非離子型或可形成離子對(duì)腈基或氨基正相鍵合相色譜溶于非極性或弱極性溶劑（極性在CHCl3以下）溶于中等極性或極性溶劑（極性在CHCl3以上）C4、C8、C18及苯基反相鍵合相色譜腈基或氨基正相鍵合相色譜硅膠吸附色譜水溶性非水溶性離子型離子交換色譜非離子型或可形成離子對(duì)C4、C8、C18反相鍵合相色譜尺寸排阻色譜分子尺寸<30nm分子尺寸30~400nmC4、C8、C18反相鍵合相色譜尺寸排阻色譜溶于CHCl3溶于醇、乙酸乙酯分子尺寸<30nm分子尺寸30~400nm《儀器分析》第八章++液相色譜分析8超臨界流體色譜法（1）原理

以超臨界流體為流動(dòng)相的色譜方法。純物質(zhì)的相圖壓力增大，流動(dòng)相密度增加，溶劑力增大，保留值降低《儀器分析》第八章++液相色譜分析特點(diǎn)：結(jié)合氣相色譜和液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)它們的不足?？梢苑治鰵庀嗌V不適應(yīng)的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性樣品比液相色譜具有更快的分析速度和更高的柱效率?？梢赃x用氣相色譜、液相色譜用的檢測(cè)器，與質(zhì)譜、傅立葉變換紅外光譜等在線聯(lián)用也較方便復(fù)雜樣品分析可以采取程序升密度的方式。《儀器分析》第八章++液相色譜分析（2）儀器

與氣相色譜儀和高效液相色譜儀類似，但有以下不同：

SFC整個(gè)色譜儀體系都處在高壓夏，必須有程序升壓的精密控制設(shè)備?？販叵到y(tǒng)類似于GC，但更加精密。柱出口流體以氣體形式釋放，一般進(jìn)入FID，因此，柱后必須裝毛細(xì)管限流器，實(shí)現(xiàn)限流器兩端的相的瞬間轉(zhuǎn)變。毛細(xì)管限流器一般長(zhǎng)約2-10cm、內(nèi)徑5-10

m。由于限流器兩端的相轉(zhuǎn)變過程屬于吸熱過程，為防止高沸點(diǎn)組分冷凝，限流器溫度保持在約300-400C。

《儀器分析》第八章++液相色譜分析（2）固定相1.要求耐溶劑沖洗。