分子診斷項目課件

分子診斷室項目介紹分子診斷項目內(nèi)容1.HBV-DNA熒光定量PCR2.流式基本應(yīng)用3.染色體核型分析分子診斷項目HBVDNA熒光定量PCR分子診斷項目 PCR技術(shù)簡介1985年美國PE-cetus公司的人類遺傳研究室mullis等人發(fā)明了具有劃時代意義的PCR技術(shù)，從而使人們夢寐以求的體外擴增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實。1988年P(guān)E-cetus公司推出了第一臺PCR熱循環(huán)儀，從而使PCR技術(shù)的自動化成為現(xiàn)實。Mullis出因其卓越的貢獻與寡核苷酸基因定點誘變的發(fā)明者Michael分享了1993年諾貝爾化學(xué)獎。隨著PCR技術(shù)的日臻成熟1995年出現(xiàn)熒光基因探針雜交定量PCR方法4分子診斷項目PCR基本原理類似DNA的體內(nèi)復(fù)制，以單鏈DNA為模板，利用DNA聚合酶依賴于模板的特性，在附加的一對寡核苷酸引物之間催化合成互補鏈的過程。5分子診斷項目DNA合成的必備要素DNAPolymerasedNTPssingle-strandedtemplateprimer6分子診斷項目定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標準，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量7分子診斷項目常規(guī)PCR與定量PCR的比較8分子診斷項目實時熒光定量PCR原理指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定義：每個反應(yīng)管的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光閾值（threshold)的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：

threshold=10×SDcycle0-159分子診斷項目Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標準品作出標準曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。10分子診斷項目熒光定量的標準曲線

標準曲線未知標本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3811分子診斷項目熒光檢測模式（1）SYBRGreenI染料（2）水解探針（Taqman）

（3）雜交探針（HybridizationProbes）（4）分子信標（molecularbeacon)

發(fā)夾引物（sunriseprimer)

蝎狀引物（scorpionprimer)

復(fù)合探針（complexprobes)12分子診斷項目探針的5'端標記一個熒光基團，3'標記另一個熒光基團。5'端熒光基團吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3’端熒光淬滅基團（FRET），正常情況下檢測不到該探針5'端熒光基團發(fā)出的熒光信號。Taqman探針原理13分子診斷項目當溶液中模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，Taq酶沿模板向前合成子鏈，當延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換；Taqman探針原理14分子診斷項目Taqman探針原理Taq酶的5‘—3’外切酶活性將探針5‘端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3’端熒光淬滅基團的屏蔽，發(fā)出熒光，熒光信號與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量。15分子診斷項目定量PCR在乙肝檢測中意義1.判斷疾病的嚴重程度和傳染性2.PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評價3.觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量4.獻血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷5.預(yù)測病情、判斷預(yù)后6.器官移植、母嬰垂直傳播16分子診斷項目17分子診斷項目標本留取及檢測步驟標本：靜脈血3ml，黃色蓋試管。標本避免溶血和脂血。檢測步驟：1.反應(yīng)液配制

2.核酸提取

3.核酸擴增結(jié)果分析：采用樣點擬合法，由標準曲線得到病毒的拷貝或IU/ML。18分子診斷項目1.分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為試劑準備區(qū)，樣品處理區(qū)，PCR擴增區(qū)。2.試驗前實驗室應(yīng)使用紫外消毒至少30分鐘。3.操作時戴一次性手套，加樣頭要求及時更換，吸液時避免飛濺。注意事項19分子診斷項目4.每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸鈉液，實驗時將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。5.所有試劑試驗前充分融化，避免反復(fù)凍融。6.每次PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)立陰陽性對照。注意事項20分子診斷項目

流式基本應(yīng)用

分子診斷項目流式細胞術(shù)的概念流式細胞術(shù)（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個微粒（通常是細胞）的多項特性，并加以定量的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征22分子診斷項目流式細胞儀的檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞顆粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體23分子診斷項目散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

細胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射光（SSC,SideScatter）

細胞顆粒度及細胞內(nèi)細胞器的相對復(fù)雜性24分子診斷項目外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細胞溶解后）25分子診斷項目熒光信號使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量26分子診斷項目數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)顯示:

直方圖(Histogram)

二維點圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

密度圖(Density)

三維圖（3DPlot）27分子診斷項目流式的臨床應(yīng)用淋巴細胞亞群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞計數(shù)細胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿HLA-B27檢查血小板功能及相關(guān)疾病HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)28分子診斷項目淋巴細胞亞群分析使用經(jīng)熒光素標記的特異單克隆抗體，進行多色染色，同時分析淋巴細胞膜上多種白細胞分化抗原（CD分子）的表達，可以將淋巴細胞亞群區(qū)分開，進行定性分析各淋巴細胞亞群的百分含量淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)，進行定量分析29分子診斷項目根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為B淋巴細胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細胞（CD3+），與細胞免疫有關(guān)總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK細胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能，能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作用。30分子診斷項目根據(jù)CD4、CD8表達，T淋巴細胞又分為T輔助/誘導(dǎo)細胞（CD3+CD4+），即Th/TiT抑制/細胞毒性細胞（CD3+CD8+）,即Ts/TcTh/Ts比值可用于評價自身免疫失調(diào)、被懷疑是免疫失調(diào)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)31分子診斷項目臨床意義診斷原發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ缦忍煨詿or球蛋白血癥）或繼發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ鏏IDS）造血干細胞移植后免疫重建（6個月NK

；9個月T、B）Th/Ts

：機體免疫功能亢進：自身免疫性疾病，如SLE、類風濕性關(guān)節(jié)炎等（治療有效恢復(fù)正常）Th/Ts

：機體免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活動性肝炎和活動性肝硬化、再障、結(jié)核、腫瘤等32分子診斷項目臨床意義移植后動態(tài)免疫監(jiān)測：急排臨床癥狀出現(xiàn)前1-5天，活化T和Th/Ts持續(xù)，>1.2預(yù)示急排；Th/Ts持續(xù)表明可能感染，比值<1.08，可能性大，<0.2應(yīng)停用免疫抑制劑；實體腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀察治療前常伴T

、Th/Ts

，放/化療有效可恢復(fù)；淋巴細胞免疫表型正?；蛑委熀竽芑謴?fù)正常者預(yù)后常較好；探索疾病發(fā)病機理、進程和預(yù)后（炎癥、腫瘤）33分子診斷項目淋巴細胞亞群雙色分析34分子診斷項目先天性無r球蛋白血癥35分子診斷項目淋巴細胞亞群雙色分析36分子診斷項目HLA-B27☆HLA-B27是MHCI類抗原，在有核細胞上廣泛表達

HLA-B27的表達與強直性脊柱炎高度相關(guān)，超過90%的強直性脊柱炎患者HLA-B27陽性。其他，如Reiters綜和癥陽性率70-90%，銀屑病性關(guān)節(jié)炎陽性率50-60%，葡萄膜炎陽性率40-50%☆檢測采用全血，無需分離淋巴細胞，操作簡單，可以快速、靈敏、準確地分析HLA-B27?！罱Y(jié)果報告檢測的平均熒光強度，根據(jù)界值判定，得到陰性/陽性結(jié)果。實驗的靈敏度為100%，特異性為97.5%。37分子診斷項目流式細胞儀的應(yīng)用（血液）

白血病和淋巴瘤免疫分型造血干細胞計數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿（PNH）診斷網(wǎng)織紅細胞計數(shù)血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表達血小板活化網(wǎng)織血小板分析38分子診斷項目流式細胞儀的應(yīng)用（腫瘤）

細胞周期和倍體分析

腫瘤相關(guān)基因表達的研究抗腫瘤藥物作用機制的研究放療/化療療效的研究

多藥耐藥基因的研究細胞凋亡的分析凋亡細胞的分析凋亡相關(guān)蛋白的分析39分子診斷項目流式標本留取

紫色蓋試管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。不能有凝塊。單細胞懸液細胞數(shù)不少于106個。40分子診斷項目

染色體核型分析41分子診斷項目基本概念染色體核型：指一個物種所特有的染色體數(shù)目和每一條染色體的形態(tài)特征。------人類體細胞中共有23對染色體，22對常染色體，一對性染色體。核型分析：將待測細胞的核型進行染色體數(shù)目、形態(tài)特征分析的過程稱核型分析。如正常女性核型：46,XX正常男性核型：46，XY。核型模式圖：是指將一個染色體組的全部染色體逐個按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。42分子診斷項目染色體模式圖43分子診斷項目人類23對染色體44分子診斷項目45分子診斷項目染色體編號(人X染色體)記述一特定帶時，需要寫明4個內(nèi)容：染色體號，長短臂，區(qū)的號序和帶的號序。這些內(nèi)容按順序?qū)?，不用間隔或加標點。如果某一帶被再細分，在原帶號數(shù)后加一小數(shù)點，編號原則仍按從著絲粒往臂端序貫編號。如1p31.2代表一號染色體短臂3區(qū)1帶第2亞帶46分子診斷項目染色體標本常規(guī)制備

方法：中期染色體G帶顯色原理：采用秋水仙素處理培養(yǎng)的細胞，使細胞停留在分裂中期，再用低滲液處理細胞，使細胞脹大，以進行染色體制片。G-帶是標本片經(jīng)過預(yù)處理后，用Giemsa染色顯示的帶紋。47分子診斷項目操作步驟

細胞培養(yǎng)：

細胞培養(yǎng)液5mL（含植物凝血素），加0.3mL肝素抗凝全血37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)68～72小時。收獲細胞：

終止培養(yǎng)前1～1.5小時加入秋水仙素。

制片：低滲-預(yù)固定-固定-滴片-干燥老化

G-顯帶，圖像分析：胰酶消化，

Giemsa染色，采集圖像，分析20-30個中期分裂相48分子診斷項目核型描述首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號：A-G染色體組的名稱1-22染色體編號X,Y性染色體del缺失der結(jié)構(gòu)重排的染色體dup重復(fù)inv倒位t易位+/-在染色體符號前表示染色體增加或減少，在染色體符號后表示染色體多出或缺少一部分49分子診斷項目檢查適應(yīng)癥及意義生殖功能障礙

在不孕癥、多發(fā)性流產(chǎn)和畸胎等有生殖功能障礙的婦夫中至少有7%~10%是染色體異常的攜帶者。常見的有染色體結(jié)構(gòu)異常如平衡易位和倒位以及數(shù)量異常如由于女性少一條X染色體造成的45，XO，或多一條Y染色體造成的47，XXY。平衡易位和倒位由于無基因的丟失，攜帶者本身常并不發(fā)病，卻可因其生殖細胞染色體異常而導(dǎo)致不孕癥、流產(chǎn)和畸胎等生殖功能障礙。性染色體數(shù)目異常除可造成不孕外，還常出現(xiàn)第二性征異常。

50分子診斷項目檢查適應(yīng)癥及意