白血病分子生物學課件

白血病分子生物學白血病分子生物學白血病的分子機制白血病的分子檢測白血病分子檢測的臨床應用白血病的分子機制基因(gene)：合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列。癌基因(oncogene)：細胞或病毒中存在的，能誘導正常細胞轉化並使之獲得新生物特徵的基因。癌基因活化的方式：

點突變染色體重排基因擴增抑癌基因(tumorsuppressorgenes)：指一類基因，其產物對細胞生長增殖起負調控的作用，並能潛在抑制細胞的惡變。

白血病的分子機制白血病的分子機制增殖過度分化阻斷凋亡受抑“二次打擊”學說D.GaryGillilandBestPractice&ResearchClinicalHaematology.2003;16:409-417白血病的分子檢測SouthernblotNorthernblotWesternblotFISHPCR測序晶片白血病的分子檢測PCR反應原理N=N0x(1+E)n

N：擴增子數量N0：起始範本數量E：擴增效率n：迴圈數白血病的分子檢測PCR理論方程白血病的分子檢測PCR方法優(yōu)點快速靈敏特異PCR方法缺點假陽性假陰性白血病的分子檢測PCR：僅適用於染色體斷裂點叢集於相對小的範圍內（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。

RT-PCR：可用於染色體斷裂點跨越很大的區(qū)域的融合基因。

巢式RT-PCR：可顯著提高反應的特異性，增加擴增效率。RQ-PCR：可定量擴增產物。白血病的分子檢測RQ-PCR（Real-timeQuantitativePCR）螢光標記擴增產物螢光標記引物特異性螢光標記探針

TaqMan探針、分子信標、雜交雙探針螢光染料直接結合擴增產物

SYBRGreenI與DNA雙鏈結合動態(tài)監(jiān)測螢光信號變化TaqMan探針法特異性高多重基因定量成本較高SYBRGreenI法成本低最適合初步篩查熔解曲線功能無法多重檢測無範本特異性靈敏度低白血病的分子檢測CT值：螢光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長（穿過閾值線）時的迴圈次數CT值與起始範本量成反比白血病的分子檢測RQ-PCR的檢測系統(tǒng)：該系統(tǒng)內置了96孔PCR儀，且在每個反應孔上均有一個監(jiān)測探頭用於檢測PCR反應管中的螢光強度。平均每8-12秒就檢測一次，以達到即時檢測的目的。系統(tǒng)中的電腦系統(tǒng)同時不斷地分析來自檢測系統(tǒng)的資訊，不斷計算每個反應管中的螢光強度，並最終得到CT值。該系統(tǒng)可以根據標準品的CT值和拷貝數自動繪製標準曲線，並計算未知樣品中的目的基因拷貝數。白血病的分子檢測RQ-PCR方法優(yōu)點：

靈敏而特異起點定量閉管化學（污染的風險低）沒有PCR後處理（無需走膠，拍照等）高度自動化定性：單數據點測定定量：多數據點測定能做基因分型及SNP鑒定RQ-PCR的操作流程從細胞或組織中抽提DNA或RNA用PCR或RT-PCR擴增特異片段將PCR產物克隆到合適的載體上純化，定量和系列稀釋質粒DNA或RNA體外轉錄成RNA片段（僅用於RNA樣品）構建標準曲線（CTυlgcopy）樣品的定量檢測校正樣品基因拷貝數白血病分子檢測的臨床應用白血病的分子生物學檢查對白血病診斷分型及預後判斷有以下幾方面意義：補充MIC檢查的不足發(fā)現新的亞型監(jiān)測白血病的微小殘留病灶（MRD）為研究白血病的發(fā)病機制打下基礎白血病分子檢測的臨床應用PCR方法檢測MRD常用的分子標誌

AML1-ETOt(8;21)(q22;q22)6~8%原發(fā)性AML，在M2中的陽性率為20~40%，在M2b中陽性率為90%少見於M4和M1，極少見於MDS和骨髓增生綜合癥AML1-ETO+白血病細胞有一定程度的分化能力，能分化至較成熟的嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，且對化療反應較敏感AML1-ETO+患者對大劑量阿糖胞苷治療效果好，具有較高的緩解率，無病生存期長，預後較其他AML亞型（M3除外）好AML1-ETO對初發(fā)患者進行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的檢測對其預後判斷及治療方案的制定相當重要AML1-ETO定性結果不能用於評價患者MRD情況RQ-PCR能即時反映體內AML1-ETO水準。連續(xù)定量AML1-ETO轉錄本水準可判定有高復發(fā)風險的患者，以便及早治療干預以防血液學復發(fā)

AML1-陰性ETO+C-KIT基因突變C-KIT為III型受體酪氨酸激酶家族（還包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成員之一AML1-ETO可誘導性表達的轉基因小鼠，並不導致白血病發(fā)生C-KIT突變可見於伴inv(16)的M4以及伴t(8;21)的M2患者26/54例(48.1%)M2b患者中檢測到C-KIT基因突變57例不伴t(8;21)的其他類型血液腫瘤患者均未檢測到C-KIT基因突變以上結果提示C-KIT突變與M2b密切相關(R=0.94,P<0.01)C-KIT基因突變C-KIT基因結構JMC-KIT基因突變外周血白細胞計數C-KIT基因突變生存曲線PML-RARαt(15;17)(q22;q21)98%M3患者繼t(15;17)之後，又先後發(fā)現4種M3特異的累及RARα的變異性染色體易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及dup(17)(q21.3;q23)，分別產生PLZF-RARα，NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融合基因臨床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融合基因患者對ATRA治療不敏感，其餘三種染色體易位患者經ATRA治療可獲完全緩解

PML-RARαAPL累及的RARα基因及其夥伴基因結構示意圖

PML-RARα由於PML基因斷裂點不同產生3種不同的PML-RARα異構體

約55%的M3患者為L型，40%為S型，5%為V型，且每位患者只表達一種PML-RARα融合蛋白形態(tài)學上S型白血病細胞常為低分化的並且這些患者可見繼發(fā)細胞遺傳學異常，V型APL患者的白血病細胞體外對ATRA的敏感度低

PML-RARαRT-PCR檢測PML-RARα是敏感且特異的APL診斷方法，還能用於治療後MRD監(jiān)測。PML-RARα陽性提示的分子復發(fā)常早於臨床復發(fā)3-6個月，為臨床採取進一步治療措施提供了保障RQ-PCR能有效反映患者在發(fā)病、治療、緩解、復發(fā)整個過程的白血病細胞負荷，在MRD監(jiān)測中比RT-PCR具有更高價值

L+陰性S+FLT3基因突變Fms-relatedtyrosinekinase3FLT3為III型受體酪氨酸激酶家族（還包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成員之一，該類受體因在造血過程中造血細胞的增殖和存活中發(fā)揮重要調控作用綜合國外各研究報導，FLT3-ITD和D835突變在AML中陽性率分別為24%(385/1585)和7%(30/429)，總陽性率超過30%，使其成為AML中最普遍發(fā)生突變的靶基因許多臨床研究發(fā)現，FLT3突變還與臨床預後密切相關，尤對60歲以下的AML患者，FLT3突變患者預後較差，且可獨立於核型之外FLT3基因突變FLT3基因突變FLT3基因主要突變類型FLT3基因突變mut-FLT3信號通路FLT3基因突變外周血白細胞計數CBFβ-MYH11inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22)主要見於M4Eo，10%不伴異常嗜酸細胞M4，少見於M2CBFβ-MYH11融合蛋白通過干擾核心結合因數（corebindingfactor,CBF）的轉錄啟動作用而致病具有CBFβ-MYH11的患者對化療敏感，預後較好，故提高檢測率尤具臨床意義

CBFβ-MYH11CBFβ-MYH11具有多種變異型，其中最常見的為A型，占80%RT-PCR檢測CBFβ-MYH11進行MRD監(jiān)測顯示，大部分患者在完全緩解時PCR轉陰，但仍有小部分長期存活者PCR仍為陽性最新研究採用RQ-PCR檢測CBFβ-MYH11轉錄本水準來評價M4Eo患者MRD情況，預示復發(fā)

NPM基因突變Nucleophosmin，為核-漿穿梭蛋白，調控p53-ARF通路見於~50%核型正常的AML患者，而在伴低危/高危核型患者中極少見主要見於M4/M5中第12號外顯子的插入/缺失伴此突變患者WBC計數高目前，此突變的預後價值各研究組報導不一，尚待進一步證實DEK-CANt(6;9)(p23;q34)主要見於M2或M4，也見於M1，MDS-RAEB伴DEK-CAN的患者年齡一般較輕，且預後較差此類患者進行分子監(jiān)測有助於判斷患者預後，調整治療方案

N-RAS基因突變?yōu)镽AS基因家族成員之一，染色體定位於1p32.2。具有GTP/GDP結合和GTPase活性，調控正常細胞的生長此基因突變存在於11-30%AML突變熱點位於codon12,13和61在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突變率較高，而在t(15;17)中低伴此突變患者外周血WBC計數低該突變預後意義尚不明WT-1基因高表達Wilmstumor1是無特異分子異常的急性白血病患者理想的MRD檢測指標伴此基因高表達者預後差，且表達程度與預後相關BCR-ABLt(9;22)(q34;q11)15~30%成人ALL及3~5%兒童ALL

9號染色體的斷裂點與CML相同，但22號染色體斷裂點具有異質性

此融合蛋白p190刺激細胞增殖的能力比p210要強。在轉基因試驗中觀察到p190誘發(fā)的白血病具有起病早、發(fā)展快和惡性程度高的特點BCR-ABL+ALL患者預後差，5年存活率<20%，因此這些患者在緩解後需進行骨髓移植治療

BCR-ABL對於自體或異體移植ALL患者，移植前後BCR-ABL的有無以及BCR-ABL的轉錄本類型與預後有關

e1a2+陰性E2A-PBX1t(1;19)(q23;p13)5~6%兒童ALL和3%成人ALL此類患者具有高的白細胞計數，高的血清乳酸脫氫酶及中樞神經系統(tǒng)癥狀，預後差，平均無病生存期（DFS）僅6個月，3年DFS為20%，需給予這些患者強化治療才能獲得較好的預後核型和E2A-PBX1檢測對此類患者的診斷和治療方案的選擇至關重要E2A-PBX1的預後價值需更多的臨床研究證實TEL-AML1t(12;21)(p13;q22)25%兒童ALL，是兒童ALL中最常見的分子異常目前為止尚未在T-ALL，AML或NHL中發(fā)現t(12;21)，在嬰兒白血病中極少報導，在成人白血病患者中頻率很低（<2%）此類患者發(fā)病年齡?。?歲~10歲），WBC計數低（<50000/L），免疫表型為前B-ALL此類患者對治療反應佳，完全緩解時間長，預後好

TEL-AML1由於12p和21q末端在常規(guī)顯帶中很相似，因此常規(guī)細胞遺傳學方法檢出率僅0.05%，需應用FISH或RT-PCR方法提高檢測陽性率TEL基因重排是獨立預後因素，RT-PCR檢測TEL-AML1融合基因能將低危險度與高危險度的ALL患者區(qū)分開來。因此早期檢測TEL-AML1融合基因對臨床預後，確定合適的治療方案都有重要意義MLL相關融合基因累及MLL基因的分子異常見於5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，還可見於治療相關白血病，尤接受topoisomeraseII抑制劑治療的患者MLL基因涉及五十餘種染色體易位，產生不同的融合蛋白，且每種融合蛋白都與特定的白血病表型相關。最常見的有：

t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4融合基因ALLt(9;11)(p22;q23)MLL-AF9融合基因AMLt(11;19)(p13;q23)MLL-ENL融合基因AML及ALLMLL相關融合基因至今，MLL相關融合蛋白的致病性還不清楚，推測其可能具有雙重作用：

——融合蛋白可能獲得新的功能，促使細胞轉化

——MLL發(fā)生斷裂後，缺失鋅指結構域的MLL不能與DNA結合，失去其轉錄活化功能，使受MLL調節(jié)的靶基因（HOX基因）表達異常，也影響造血細胞的發(fā)育

MLL-AF4t(4;11)(q21;q23)t(4;11)的發(fā)生率在不同年齡段是不同的，在嬰兒ALL中最多見，為50~70%，而在兒童和成人中較低，分別為2%和3~6%此類患者發(fā)病年齡低（通常<2歲），白細胞計數高，常伴有內臟巨大並累及中樞神經系統(tǒng)此類患者病情兇險，預後差?；颊邔藴手委煼桨负芸赡軣o效，需給予強化治療。目前應用高劑量Ara-C治療，使這些患者預後有所提高

MLL-AF4對≤2歲的嬰幼兒急性白血病患者應常規(guī)進行MLL-AF4融合基因的檢測以篩選出高?；颊?，給予強化治療提高生存率RT-PCR可在所有t(4;11)患者初發(fā)時檢測到MLL-AF4融合基因。由於該融合基因累及的2個基因的斷裂點變異性較大，因此PCR應包括所有斷裂點以免產生假陰性結果

TAL1基因重排

t(1;14)(p32;q11)，TAL1-TCRδ融合基因

3%T-ALL

易位使TAL1基因與TCRδ位點並置，其5′端正常轉錄調節(jié)被TCRδ5′部分所取代，而後者在T細胞中有高表達

TAL1基因重排1p32缺失，SIL-TAL1融合基因

16~26%T-ALL該重組僅見於T-ALL，是T-ALL的一個有用的克隆標誌缺失部分可能為TAL1基因的調控序列，使TAL1基因表達失控，導致與染色體易位相似的表型常規(guī)遺傳學方法檢測不到這一異常，而SIL-TAL1融合處特異的序列能作為這類患者特異的分子標誌用於PCR檢測TAL1基因重排TAL1異常僅見於T-ALL，尚未見於B-ALL，AML和T細胞NHL，是兒童T-ALL中最常見非隨機遺傳缺陷，是監(jiān)測大多數T-ALL的侯選基因伴TAL1異常的患者血象表現為高白細胞計數，高血紅蛋白含量，免疫表型為CD2+/CD10–儘管在治療反應上，有TAL1重排患者和無TAL1重排患者無顯著差異，但伴TAL1重排患者4年無事件生存率（EFS）高於不伴TAL1重排的患者，分別為59±11%和44±7%，提示伴TAL1重排患者預後較好

HOX11基因異常表達

t(10;14)(q24;q11)，t(7;10)(q34;q24)7%的T-ALL易位使HOX11基因受控於TCRδ和TCRβ基因調控序列，導致其異常表達另有部分HOX11高表達患者核型正常伴有此種異常的患者對聯(lián)合化療反應好，預後也較其他T-ALL患者要好，完全緩解率為100%，平均無病生存期為46個月，3年無病生存率為75%HOX11L2基因異常表達t(5;14)(q35;q32)20%的兒童T-ALL易位使HOX11L2基因處於CTIP2調控元件的控制下，而CTIP2基因在T淋巴細胞分化時高度表達在隨訪患者中檢測到高水準HOX11L2說明白血病細胞的存在，強烈預示復發(fā)，而完全緩解患者HOX11L2表達水準迅速降低，並維持在一個低水準?？梢奌OX11L2的表達水準可作為MRD檢測的標誌

NOTCH1基因突變NOTCH1信號對CLP(commonlymphoidprogenitors)向T細胞定向以及前T細胞受體複合物組裝是必須的35-50%T-ALL患者存在此基因突變伴NOTCH1基因突變的成年T-ALL患者預後較差NOTCH1基因突變NOTCH1基因結構NOTCH1基因突變生存曲線BCR-ABLt(9;22)(q34;q11)>90%CML患者BCR-ABL融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激酶活性較正常ABL高，可能是BCR對ABL激酶活性調節(jié)區(qū)的作用所致由於<5%CML患者為隱匿性Ph染色體，因此無Ph染色體CML患者還需使用更靈敏的分子檢測手段如FISH或RT-PCR檢測BCR-ABL融合基因RT-PCR還能區(qū)分e1-a2和b2-a2/b3-a2二種BCR-ABL轉錄本，從而區(qū)分ALL患者與CML急淋變患者，進而分別對兩種不同患者採用不同的治療方案BCR-ABL巢式RT-PCR檢測BCR-ABL融合基因用於CML移植患者移植後MRD監(jiān)測?？稍诨颊哐簩W復發(fā)前的6~24個月骨髓檢測就呈陽性。RQ-PCR還能動態(tài)觀察患者治療後BCR-ABL轉錄本水準變化情況，反映療效。

b3a2+b2a2+陰性GATA2基因突變調控早期造血幹細胞增殖分化的轉錄因數，維持造血幹祖細胞的增殖和自我更新能力CML急變患者中新發(fā)現GATA2基因突變，而CML慢性期、加速期，AML（M1-M7），MDS，ALL，CLL，淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常對照均未發(fā)現該突變，可見GATA2基因突變僅與CML急變相關，是CML疾病進展過程中的獲得性突變?？偘l(fā)生率為12.5%（5/40），且均造成CML急粒單變GATA2基因突變與CML患者疾病進展和預後的關係有待進一步闡明JAK2基因突變Januskinase2此基因突變主要見於MPD和MDS，另可存在於部分AML尤M2突變?yōu)閂617F突變去除了JAK2JH2負性調控，導致該基因的持續(xù)活化，賦予細胞增殖存活優(yōu)勢JAK2可成為靶向治療的靶點MDS相關基因異常Delta樣(Dlk)基因編碼Dlk蛋白在MDS明顯增高者55%，而AML僅10%，可能是MDS特異性基因，但作為診斷MDS的標誌基因尚待進一步確定MDS相關基因異常RAS此原癌基因超家族編碼鳥苷三磷酸水解酶(GTPase)調節(jié)細胞生長相關信號ras癌基因的活化，尤其是N-ras的啟動可在約35%的MDS患者中發(fā)生FMS為集落刺激因數1，控制單核-巨噬細胞生長、分化及功能fms基因的突變可在16%的MDS患者中發(fā)現ras和fms突變主要見於粒-單細胞分化的疾病，即MDS中的CMML，患者生存期短，轉AML多MDS相關基因異常p53在MDS時，p53突變較少見(<5%)，但在較為進展的病例中可高達15%p53突變意味著化療耐藥和生存期縮短，因而是一種有意義的預後指標FLT310%MDS有FLT3點突變，加快進展為AML，但FLT3-ITD少見AML1(RUNX1)為MDS較常見的點突變，發(fā)生率25%，導致核心結合因數(CBF)亞單位正常功能缺失，易轉化AMLIg/TCR基因重排Ig/TCR基因重排檢測，對決定白血病的細胞來源系列乃至分化階段，有重大意義在B系ALL中分別有95%，54%