《第3章 基因工程》知識總結(jié)

學(xué)而優(yōu)·教有方PAGEPAGE12第三章基因工程第一節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具一、基因工程的概念1.基因工程的概念操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平操作原理基因重組操作結(jié)果按照人類的需要定向改造生物的遺傳特性2．基因重組的類型（1）真核生物有性生殖過程中，減數(shù)分裂時發(fā)生的基因重組：①交換型；②自由組合型。（2）肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)生的基因重組。（3）基因工程中人工操作導(dǎo)致的基因重組。3．幾乎所有生物的DNA分子都是由4種脫氧核苷酸形成的規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。4．所有生物都共用一套遺傳密碼。5．目的基因可在受體細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立表達(dá)的原因是基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)和功能單位，具有相對獨(dú)立性。二、分子手術(shù)刀—限制性內(nèi)切核酸酶1.全稱和簡稱全稱：_限制性內(nèi)切核酸酶_簡稱：__限制酶_2.來源：主要是從_原核生物__中分離純化出來的3.作用：①能夠識別_雙鏈_DNA分子的某種_特定核苷酸序列。②使_每一條_鏈中_特定部位_的_磷酸二酯鍵__斷開。4.作用部位：_磷酸二酯鍵__5.識別序列：大多數(shù)限制酶的識別序列由_6_個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由_4_個、_8_個或__其他數(shù)量_的核苷酸組成。6.切割結(jié)果：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式__黏性末端_和__平末端__。（1）EcoRⅠ限制酶切割EcoRⅠ識別序列為GAATTCEcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵（2）SmaⅠ限制酶切割SmaⅠ識別序列為CCCGGGSmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵二、分子縫合針—DNA連接酶1.功能：將__兩個DNA片段連接起來_，恢復(fù)被限制酶切開的_磷酸二酯鍵__。2.分類和對比種類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只縫合黏性末端縫合黏性末端平末端作用恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵3．比較與DNA有關(guān)的六種酶名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶或熱穩(wěn)定DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個核糖核苷酸依次連接到單鏈末端三、分子運(yùn)輸車——載體1．種類：質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等。2．常用載體——質(zhì)粒（1）本質(zhì)：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）質(zhì)粒作為載體所具備的條件及原因條件原因穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制或整合到受體DNA上能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)可攜帶多個或多種外源基因具有特殊的標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選無毒害作用對受體細(xì)胞無毒害作用，避免受體細(xì)胞受到損傷（3）作用①作為運(yùn)輸工具，將外源基因?qū)爰?xì)胞。②質(zhì)粒攜帶外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制。探究.實(shí)踐：DNA的粗提取與鑒定1.提取思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在的差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對他們進(jìn)行提取。2.提取原理：①DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)；②DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。3.鑒定原理：在一定溫度下（沸水?。珼NA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。4.比較DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同溶解規(guī)律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出5．DNA粗提取中的注意事項(xiàng)（1）本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)?？蛇x用雞血細(xì)胞作材料。（2）加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。（3）二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。（4）提取植物細(xì)胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。（5）在DNA進(jìn)一步提純時，選用冷卻的95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。第二節(jié)基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取（一）目的基因的篩選與獲取1.目的基因概念在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于__改變受體細(xì)胞性狀__或__獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物_等的基因就是目的基因（根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__編碼蛋白質(zhì)的基因___）。2.篩選目的基因的方法（1）從相關(guān)的__已知結(jié)構(gòu)__和__功能清晰__的基因中進(jìn)行篩選。（2）獲取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(從基因文庫中獲取,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,通過化學(xué)方法人工合成))3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）PCR的概：PCR是__聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)__的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)_DNA半保留復(fù)制_的原理，在_體外_提供參與DNA復(fù)制的__各種組分__與_反應(yīng)條件_，對_目的基因的核苷酸序列_進(jìn)行__大量復(fù)制__的技術(shù)。①全稱：__聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)___②原理：___DNA半保留復(fù)制___③操作環(huán)境：__體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）___④目的：__對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制___⑤優(yōu)點(diǎn)：___可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因___（2）DNA體內(nèi)復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料解旋酶打開DNA雙鏈DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸注：引物是一小段能與_DNA母鏈__的一段堿基序列__互補(bǔ)配對_的_短單鏈核酸__。（3）DNA體外復(fù)制（PCR）的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸90℃以上高溫打開DNA雙鏈（變性溫度）耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈緩沖液（含Mg2+)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶其他不同的溫度變性、復(fù)性和延伸需要不同溫度注：復(fù)制的原料實(shí)為dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同時水解產(chǎn)生能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加ATP。（4）過程目的基因DNA__受熱變性__后_解為單鏈_，_引物與單鏈相應(yīng)_互補(bǔ)序列_結(jié)合；然后以__單鏈DNA__為模板在_DNA聚合酶_作用下進(jìn)行_延伸__，即將4種_脫氧核苷酸__加到__引物的3’__，如此__重復(fù)循環(huán)多次__，每次循環(huán)一般可以分為_變性、復(fù)性和延伸_三步。注：變性溫度上升到90℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到55℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸溫度上升到72℃左右，Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸拓展：DNA復(fù)制的相關(guān)計(jì)算1.子代DNA分子總數(shù)：_2n_個；2.第n代產(chǎn)生的DNA數(shù)：_2n-1_個；3.子代DNA脫氧核苷酸鏈總數(shù)=_2n+1_條4.第n代產(chǎn)生的DNA鏈數(shù)：_2n_條①n代后，DNA分子有_2n_個②n代后，DNA鏈有_2n+1_條③第____代出現(xiàn)完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有_2n__個⑤n代后，共消耗_2n+1-2_個引物⑥第n代復(fù)制，消耗了_2n_個引物⑦n代后，完整的目的基因有_2n-2n_個4.獲取目的基因的其他方法（1）構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。①基因組文庫：包含一種生物所有的基因。②部分基因文庫：只包含一種生物一部分基因，如cDNA文庫。（2）利用化學(xué)方法人工合成：用DNA合成儀，要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知，不需要模板。（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1.基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體必須包括_目的基因_、__標(biāo)記基因_、_啟動子_、_終止子_等（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有_復(fù)制原點(diǎn)_）。（1）啟動子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_DNA_片段。②位置：位于基因的_上游_，緊挨__轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)__。③功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA___。④特殊類型：_誘導(dǎo)型啟動子___。⑤誘導(dǎo)型啟動子的特點(diǎn)：當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)__。（2）終止子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_DNA__片段。②位置：位于基因的_下游_。③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來__。注：啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比比較項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰的堿基mRNA上三個相鄰的堿基位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）（3）標(biāo)記基因①作用：_便于重組DNA分子的篩選_②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等（4）基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程一般用同種或能產(chǎn)生相同末端的限制酶分別切割載體和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—花粉管通道法（1）操作方式①用__微量注射器_將__含目的基因的DNA溶液_直接注入_子房_中。②在_植物受粉后_的一定時間內(nèi)，_剪去柱頭_，將__DNA溶液___滴加在_花粉管通道__上，使目的基因借助_花柱切面__進(jìn)入_胚囊_。（2）受體細(xì)胞：_受精卵__。2.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程__。注：此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌特點(diǎn)：①能在自然條件下侵染__雙子葉植物_和_裸子植物__，而對大多數(shù)__單子葉植物_沒有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有__Ti質(zhì)粒_，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將_Ti質(zhì)粒_上的_T-DNA_（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移_到被侵染的細(xì)胞，并且將其__整合到該細(xì)胞的染色體DNA上__。（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：將目的基因插入_Ti質(zhì)粒的T-DNA__中，通過農(nóng)桿菌的_轉(zhuǎn)化_作用，就可以使目的基因_進(jìn)入植物細(xì)胞_，并___整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上__，使目的基因能夠_維持穩(wěn)定和表達(dá)__。3.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞—顯微注射法1.受體細(xì)胞：_受精卵_注：受精卵容易表現(xiàn)出全能性。構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純2.構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純4.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞—Ca2+處理法（1）受體細(xì)胞：常用__原核生物__作為受體細(xì)胞，其中以__大腸桿菌_最廣泛（2）原核生物的優(yōu)點(diǎn)：_繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少、易于培養(yǎng)__（3）Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）的一般過程：（四）目的基因的檢測與鑒定檢測目的檢測方法判斷標(biāo)準(zhǔn)目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNADNA分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶個體水平的檢測如抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性1.DNA片段的電泳鑒定（1）實(shí)驗(yàn)原理：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。帶電粒子在電場作用下，向與其攜帶電荷相反的電極移動。（2）影響DNA分子的遷移率的因素：DNA的分子大小，DNA分子的構(gòu)象，凝膠的濃度。（3）電泳出現(xiàn)位置不等的幾條條帶，說明存在長短不一的DNA片段，鑒定的PCR產(chǎn)物不純凈。第三節(jié)基因工程的應(yīng)用一、基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用分類實(shí)例處理或作用轉(zhuǎn)基因抗蟲植物轉(zhuǎn)基因抗蟲棉、玉米、大豆、水稻和馬鈴薯從某些生物中分離出抗蟲基因?qū)胱魑铮怪哂锌瓜x性狀。可減少因化學(xué)農(nóng)藥的使用而造成的環(huán)境污染和對人類健康的損害，降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量

。轉(zhuǎn)基因抗病植物抗病毒轉(zhuǎn)基因甜椒、番木瓜和煙草等將源于某些病毒、真菌等的抗病基因?qū)胱魑?培育出抗病作物。抗病毒的目的基因病毒外殼蛋白基因抗真菌的目的基因幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)基因抗逆植物抗除草劑玉米、轉(zhuǎn)魚抗寒基因番茄等抗逆性基因：調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的基因(提高作物抗鹽堿、抗干旱)；抗除草劑基因；魚的抗凍蛋白基因。改良植物的品質(zhì)高賴氨酸玉米、含大量纖維素的轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因矮牽牛改善植物的營養(yǎng)成分含量（如氨基酸、蛋白質(zhì)）或提升觀賞價值等。提高動物的生長速率轉(zhuǎn)生長激素基因的鯉魚由于外源生長激素基因的表達(dá)可以使轉(zhuǎn)基因動物生長更快，可將這類基因?qū)雱游矬w內(nèi)，以提高動物的生長速率。改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)轉(zhuǎn)腸乳糖酶基因牛將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M，使獲得的轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低。二、基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用分類實(shí)例處理或作用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物乳腺生物反應(yīng)器（乳房生物反應(yīng)器）將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起。轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體克隆豬器官抑制或除去抗原決定基因，結(jié)合克隆技術(shù)培育出沒有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。

基因治療鐮狀細(xì)胞貧血的治療方案基因治療的策略主要有基因置換、基因修復(fù)、基因增補(bǔ)、基因失活等。三、基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用淀粉酶、凝乳酶、天冬氨酸和苯丙氨酸等的生產(chǎn)利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等。如將編碼牛凝乳酶的基因?qū)氪竽c桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶。四、乳腺生物反應(yīng)器與基因工程菌生產(chǎn)藥物比較比較項(xiàng)目乳腺生物反應(yīng)器工程菌基因表達(dá)合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，產(chǎn)生的藥物蛋白可能沒有活性。受體細(xì)胞動物的受精卵微生物細(xì)胞導(dǎo)入目的基因的方式顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法藥物提取從動物乳汁中提取從微生物細(xì)胞中提取第四節(jié)基因工程的延伸——蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程：是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。1.概念理解（1）基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系。（2）操作：基因修飾或基因合成。

（3）結(jié)果：改造了現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出新的蛋白質(zhì)。

（4）目的：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)。

2.操作過程從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有的氨基酸序列→找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由1.基因工程的實(shí)質(zhì)：將一種生物的_基因轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，后者可以產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，進(jìn)而表現(xiàn)出新的性狀。2.基因工程的局限性：__只能生產(chǎn)自然界中已存在的蛋白質(zhì)____3.蛋白質(zhì)工程崛起的緣由：（1）基因工程原則上只能生產(chǎn)自然界中已存在的蛋白質(zhì)。（2）天然蛋白質(zhì)是生物長期進(jìn)化過程中形成的，它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要，卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。二、蛋白質(zhì)工程的基本原理1.蛋白質(zhì)工程的目標(biāo)：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)__功能__的特定需求，因此要對蛋白質(zhì)的__結(jié)構(gòu)_進(jìn)行設(shè)計(jì)改造。2.蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)：__改造或合成基因（定向改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造新的蛋白質(zhì)）。3.天然蛋白質(zhì)合成過程：天然蛋白質(zhì)合成的過程是按照__中心法則__進(jìn)行的?；颉磉_(dá)→形成具有特定氨基酸序列的多肽鏈→形成具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)→形式生物功能4.蛋白質(zhì)工程思路蛋白質(zhì)工程與天然蛋白質(zhì)合成的過程_相反_，而從__預(yù)期的蛋白質(zhì)功能_出發(fā)→設(shè)計(jì)_預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)_→推測__應(yīng)有的氨基酸序列_→找到并改變_相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列_或__合成新基因_→獲得所需要的蛋白質(zhì)。三、蛋白質(zhì)工程和基因工程的比較比較項(xiàng)目蛋白質(zhì)工程基因工程操作對象基因基因操作起點(diǎn)預(yù)期蛋白質(zhì)功能目的基因操作水平DNA分子水平DNA分子水平操作流程預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測氨基酸序列→找到并改變對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→獲得所需要的蛋白質(zhì)目的基因的篩選與獲取→構(gòu)建基因表達(dá)載體→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞→目的基因的檢測與鑒定結(jié)果可生產(chǎn)自然界沒有的蛋白質(zhì)可生產(chǎn)自然界已有的蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)通過改造或合成基因來定向改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造新的蛋白質(zhì)將一種生物的基因轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，后者可以產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，進(jìn)而表現(xiàn)出新的性狀聯(lián)系①蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上延伸出來的第二代基因工程；②蛋白質(zhì)工程離不開基因工程，其包含基因工程基本操作。四、蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用1.醫(yī)藥工業(yè)方面（1）科學(xué)家通過對胰島素基因的改造，研發(fā)出速效胰島素類似物產(chǎn)品。（2）eq\x(干擾素半胱氨酸)eq\o(→,\s\up7(改造))eq\x(干擾素絲氨酸)體外很難保存，但在體外－70℃下可以保存半年（3）人－鼠嵌合抗體：降低免疫反應(yīng)強(qiáng)度。2.其他工業(yè)方面利用蛋白質(zhì)工程獲得枯草桿菌蛋白酶的突變體，篩選出符合工業(yè)化生產(chǎn)需求的突變體，提高該酶的使用價值。農(nóng)業(yè)方面①科學(xué)家嘗試改造某些參與調(diào)控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加糧食的產(chǎn)量。②科學(xué)家利用蛋白質(zhì)工程的思路設(shè)計(jì)優(yōu)良微生物農(nóng)藥，通過改造微生物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)微生物防治病蟲害的效果。4.其他（1）改進(jìn)酶的性能或開發(fā)新的工業(yè)用酶。（2）改造某些參與調(diào)控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加糧食的產(chǎn)量。（3）改造微生物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使它防治病蟲害的效果增強(qiáng)。5.蛋白質(zhì)工程現(xiàn)狀蛋白質(zhì)工程是一項(xiàng)難度很大的工程；主要原因是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能必須依賴于正確的高級結(jié)構(gòu)，而這種高級結(jié)構(gòu)往往十分復(fù)雜。學(xué)而優(yōu)·教有方PAGEPAGE23第三章基因工程第一節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具一、基因工程的概念1.基因工程的概念操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平操作原理基因重組操作結(jié)果按照人類的需要定向改造生物的遺傳特性2．基因重組的類型（1）真核生物有性生殖過程中，減數(shù)分裂時發(fā)生的基因重組：①交換型；②自由組合型。（2）肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)生的基因重組。（3）基因工程中人工操作導(dǎo)致的基因重組。3．幾乎所有生物的DNA分子都是由4種脫氧核苷酸形成的規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。4．所有生物都共用一套遺傳密碼。5．目的基因可在受體細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立表達(dá)的原因是基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)和功能單位，具有相對獨(dú)立性。二、分子手術(shù)刀—限制性內(nèi)切核酸酶1.全稱和簡稱全稱：_限制性內(nèi)切核酸酶_簡稱：__限制酶_2.來源：主要是從_原核生物__中分離純化出來的3.作用：①能夠識別_雙鏈_DNA分子的某種_特定核苷酸序列。②使_每一條_鏈中_特定部位_的_磷酸二酯鍵__斷開。4.作用部位：_磷酸二酯鍵__5.識別序列：大多數(shù)限制酶的識別序列由_6_個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由_4_個、_8_個或__其他數(shù)量_的核苷酸組成。6.切割結(jié)果：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式__黏性末端_和__平末端__。（1）EcoRⅠ限制酶切割EcoRⅠ識別序列為GAATTCEcoRⅠ切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵（2）SmaⅠ限制酶切割SmaⅠ識別序列為CCCGGGSmaⅠ切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵二、分子縫合針—DNA連接酶1.功能：將__兩個DNA片段連接起來_，恢復(fù)被限制酶切開的_磷酸二酯鍵__。2.分類和對比種類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點(diǎn)只縫合黏性末端縫合黏性末端平末端作用恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵3．比較與DNA有關(guān)的六種酶名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶或熱穩(wěn)定DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個核糖核苷酸依次連接到單鏈末端三、分子運(yùn)輸車——載體1．種類：質(zhì)粒、噬菌體、動植物病毒等。2．常用載體——質(zhì)粒（1）本質(zhì)：質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。（2）質(zhì)粒作為載體所具備的條件及原因條件原因穩(wěn)定存在并能自我復(fù)制或整合到受體DNA上能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)可攜帶多個或多種外源基因具有特殊的標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選無毒害作用對受體細(xì)胞無毒害作用，避免受體細(xì)胞受到損傷（3）作用①作為運(yùn)輸工具，將外源基因?qū)爰?xì)胞。②質(zhì)粒攜帶外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制。探究.實(shí)踐：DNA的粗提取與鑒定1.提取思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在的差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法對他們進(jìn)行提取。2.提取原理：①DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA與蛋白質(zhì)；②DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。3.鑒定原理：在一定溫度下（沸水浴），DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色，因此二苯胺試劑可以作為鑒定DNA的試劑。4.比較DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同溶解規(guī)律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出5．DNA粗提取中的注意事項(xiàng)（1）本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核(無DNA)。可選用雞血細(xì)胞作材料。（2）加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。（3）二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。（4）提取植物細(xì)胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。（5）在DNA進(jìn)一步提純時，選用冷卻的95%的酒精的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。第二節(jié)基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲?。ㄒ唬┠康幕虻暮Y選與獲取1.目的基因概念在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于__改變受體細(xì)胞性狀__或__獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物_等的基因就是目的基因（根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__編碼蛋白質(zhì)的基因___）。2.篩選目的基因的方法（1）從相關(guān)的__已知結(jié)構(gòu)__和__功能清晰__的基因中進(jìn)行篩選。（2）獲取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(從基因文庫中獲取,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,通過化學(xué)方法人工合成))3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）PCR的概：PCR是__聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)__的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)_DNA半保留復(fù)制_的原理，在_體外_提供參與DNA復(fù)制的__各種組分__與_反應(yīng)條件_，對_目的基因的核苷酸序列_進(jìn)行__大量復(fù)制__的技術(shù)。①全稱：__聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)___②原理：___DNA半保留復(fù)制___③操作環(huán)境：__體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）___④目的：__對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制___⑤優(yōu)點(diǎn)：___可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因___（2）DNA體內(nèi)復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料解旋酶打開DNA雙鏈DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸注：引物是一小段能與_DNA母鏈__的一段堿基序列__互補(bǔ)配對_的_短單鏈核酸__。（3）DNA體外復(fù)制（PCR）的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸90℃以上高溫打開DNA雙鏈（變性溫度）耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈緩沖液（含Mg2+)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶其他不同的溫度變性、復(fù)性和延伸需要不同溫度注：復(fù)制的原料實(shí)為dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同時水解產(chǎn)生能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加ATP。（4）過程目的基因DNA__受熱變性__后_解為單鏈_，_引物與單鏈相應(yīng)_互補(bǔ)序列_結(jié)合；然后以__單鏈DNA__為模板在_DNA聚合酶_作用下進(jìn)行_延伸__，即將4種_脫氧核苷酸__加到__引物的3’__，如此__重復(fù)循環(huán)多次__，每次循環(huán)一般可以分為_變性、復(fù)性和延伸_三步。注：變性溫度上升到90℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到55℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸溫度上升到72℃左右，Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由5′端向3′端延伸拓展：DNA復(fù)制的相關(guān)計(jì)算1.子代DNA分子總數(shù)：_2n_個；2.第n代產(chǎn)生的DNA數(shù)：_2n-1_個；3.子代DNA脫氧核苷酸鏈總數(shù)=_2n+1_條4.第n代產(chǎn)生的DNA鏈數(shù)：_2n_條①n代后，DNA分子有_2n_個②n代后，DNA鏈有_2n+1_條③第____代出現(xiàn)完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有_2n__個⑤n代后，共消耗_2n+1-2_個引物⑥第n代復(fù)制，消耗了_2n_個引物⑦n代后，完整的目的基因有_2n-2n_個4.獲取目的基因的其他方法（1）構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。①基因組文庫：包含一種生物所有的基因。②部分基因文庫：只包含一種生物一部分基因，如cDNA文庫。（2）利用化學(xué)方法人工合成：用DNA合成儀，要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知，不需要模板。（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1.基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體必須包括_目的基因_、__標(biāo)記基因_、_啟動子_、_終止子_等（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有_復(fù)制原點(diǎn)_）。（1）啟動子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_DNA_片段。②位置：位于基因的_上游_，緊挨__轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)__。③功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA___。④特殊類型：_誘導(dǎo)型啟動子___。⑤誘導(dǎo)型啟動子的特點(diǎn)：當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)__。（2）終止子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_DNA__片段。②位置：位于基因的_下游_。③功能：使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來__。注：啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比比較項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰的堿基mRNA上三個相鄰的堿基位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）（3）標(biāo)記基因①作用：_便于重組DNA分子的篩選_②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等（4）基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程一般用同種或能產(chǎn)生相同末端的限制酶分別切割載體和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—花粉管通道法（1）操作方式①用__微量注射器_將__含目的基因的DNA溶液_直接注入_子房_中。②在_植物受粉后_的一定時間內(nèi)，_剪去柱頭_，將__DNA溶液___滴加在_花粉管通道__上，使目的基因借助_花柱切面__進(jìn)入_胚囊_。（2）受體細(xì)胞：_受精卵__。2.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程__。注：此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌特點(diǎn)：①能在自然條件下侵染__雙子葉植物_和_裸子植物__，而對大多數(shù)__單子葉植物_沒有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有__Ti質(zhì)粒_，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將_Ti質(zhì)粒_上的_T-DNA_（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移_到被侵染的細(xì)胞，并且將其__整合到該細(xì)胞的染色體DNA上__。（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：將目的基因插入_Ti質(zhì)粒的T-DNA__中，通過農(nóng)桿菌的_轉(zhuǎn)化_作用，就可以使目的基因_進(jìn)入植物細(xì)胞_，并___整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上__，使目的基因能夠_維持穩(wěn)定和表達(dá)__。3.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞—顯微注射法1.受體細(xì)胞：_受精卵_注：受精卵容易表現(xiàn)出全能性。構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純2.構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純4.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞—Ca2+處理法（1）受體細(xì)胞：常用__原核生物__作為受體細(xì)胞，其中以__大腸桿菌_最廣泛（2）原核生物的優(yōu)點(diǎn)：_繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少、易于培養(yǎng)__（3）Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）的一般過程：（四）目的基因的檢測與鑒定檢測目的檢測方法判斷標(biāo)準(zhǔn)目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNADNA分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗原—抗體雜交技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶個體水平的檢測如抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性1.DNA片段的電泳鑒定（1）實(shí)驗(yàn)原理：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。帶電粒子在電場作用下，向與其攜帶電荷相反的電極移動。（2）影響DNA分子的遷移率的因素：DNA的分子大小，DNA分子的構(gòu)象，凝膠的濃度。（3）電泳出現(xiàn)位置不等的幾條條帶，說明存在長短不一的DNA片段，鑒定的PCR產(chǎn)物不純凈。第三節(jié)基因工程的應(yīng)用一、基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用分類實(shí)例處理或作用轉(zhuǎn)基因抗蟲植物轉(zhuǎn)基因抗蟲棉、玉米、大豆、水稻和馬鈴薯從某些生物中分離出抗蟲基因?qū)胱魑?，使之具有抗蟲性狀?？蓽p少因化學(xué)農(nóng)藥的使用而造成的環(huán)境污染和對人類健康的損害，降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量

。轉(zhuǎn)基因抗病植物抗病毒轉(zhuǎn)基因甜椒、番木瓜和煙草等將源于某些病毒、真菌等的抗病基因?qū)胱魑?培育出抗病作物。抗病毒的目的基因病毒外殼蛋白基因抗真菌的目的基因幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)基因抗逆植物抗除草劑玉米、轉(zhuǎn)魚抗寒基因番茄等抗逆性基因：調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的基因(提高作物抗鹽堿、抗干旱)；抗除草劑基因；魚的抗凍蛋白基因。改良植物的品質(zhì)高賴氨酸玉米、含大量纖維素的轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因矮牽牛改善植物的營養(yǎng)成分含量（如氨基酸、蛋白質(zhì)）或提升觀賞價值等。提高動物的生長速率轉(zhuǎn)生長激素基因的鯉魚由于外源生長激素基因的表達(dá)可以使轉(zhuǎn)基因動物生長更快，可將這類基因?qū)雱游矬w內(nèi)，以提高動物的生長速率。改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)轉(zhuǎn)腸乳糖酶基因牛將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M，使獲得的轉(zhuǎn)基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低。二、基因工程在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用分類實(shí)例處理或作用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物乳腺生物反應(yīng)器（乳房生物反應(yīng)器）將藥用蛋白基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起。轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體克隆豬器官抑制或除去抗原決定基因，結(jié)合克隆技術(shù)培育出沒有免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆豬器官。

基因治療鐮狀細(xì)胞貧血的治療方案基因治療的策略主要有基因置換、基因修復(fù)、基因增補(bǔ)、基因失活等。三、基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用淀粉酶、凝乳酶、天冬氨酸和苯丙氨酸等的生產(chǎn)利用基因工程菌生產(chǎn)食品工業(yè)用酶、氨基酸和維生素等。如將編碼牛凝乳酶的基因?qū)氪竽c桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶。四、乳腺生物反應(yīng)器與基因工程菌生產(chǎn)藥物比較比較項(xiàng)目乳腺生物反應(yīng)器工程菌基因表達(dá)合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，產(chǎn)生的藥物蛋白可能沒有活性。受體細(xì)胞動物的受精卵微生物細(xì)胞導(dǎo)入目的基因的方式顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法藥物提取從動物乳汁中提取從微生物細(xì)胞中提取第四節(jié)基因工程的延伸——蛋白質(zhì)工程一、蛋白質(zhì)工程：是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過改造或合成基因，來改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或