醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗技術(shù)2

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗技術(shù)

概述

免疫學(xué)是一門既古老又嶄新的學(xué)科，涉及醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域，并與理工農(nóng)各學(xué)科相互滲透。醫(yī)

學(xué)免疫學(xué)是生命科學(xué)的前沿學(xué)科，也是醫(yī)學(xué)生的主干必修課程之一。目前免疫學(xué)的研究已經(jīng)

進(jìn)入了一個嶄新的時代?，F(xiàn)代免疫學(xué)的研究和應(yīng)用涉及到生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。它與分子生

物學(xué)一樣是生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床工作不可缺的工具。

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是一門實踐性、應(yīng)用性很強的學(xué)科，教學(xué)過程分為理論教學(xué)和實驗教學(xué)。實驗

教學(xué)作為免疫學(xué)教學(xué)的重要環(huán)節(jié)，直接影響大人才的培養(yǎng)目標(biāo)的實現(xiàn)，特別是在培養(yǎng)學(xué)生的

科學(xué)態(tài)度、實踐技能、創(chuàng)新能力方面，具有重要的地位。

一醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗?zāi)康呐c要求

醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗課程的開設(shè)，目的在于不僅使學(xué)生驗證部分理論知識和加深對課堂講授

內(nèi)容的理解，更重要的是在掌握系統(tǒng)理論知識的基礎(chǔ)匕學(xué)習(xí)和掌握免疫學(xué)實驗的基本技術(shù)

和技能，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析和解決問題的能力，以及嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度和創(chuàng)新精

神，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。

1.基礎(chǔ)性實驗要求學(xué)生系統(tǒng)學(xué)習(xí)和掌握常用的經(jīng)典免疫學(xué)實驗方法和現(xiàn)代免疫學(xué)實驗

技術(shù)，使學(xué)生理解和鞏固所學(xué)的理論知識，掌握相應(yīng)的實驗方法和實驗技能。

2.綜合性實驗實驗內(nèi)容涉及本課程的綜合知識或相關(guān)課程知識的實驗，往往由多種實

驗手段、技術(shù)和層次的實驗內(nèi)容所組成。通過綜合性實驗，進(jìn)一步訓(xùn)練學(xué)生對所學(xué)知識和實

驗技術(shù)的綜合運用能力、獨立工作能力和對實驗結(jié)果的綜合分析能力。

3.設(shè)計性實驗是在完成基礎(chǔ)性試驗和綜合性試驗的基礎(chǔ)上，給定實驗?zāi)康?、要求和?/p>

提供的實驗條件，由學(xué)生自行查閱資料，自選題目、設(shè)計實驗方案，并在老師指導(dǎo)下，進(jìn)行

試驗，最后以論文形式寫出實驗報告。目的在于激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新性思維，培養(yǎng)學(xué)生的科研能

力，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。

二醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗室規(guī)則

1.學(xué)生在上實驗課前，應(yīng)對實驗內(nèi)容進(jìn)行預(yù)習(xí)，明確實驗?zāi)康?、要求，了解實驗原理?/p>

操作步驟，熟悉所要使用的儀器、藥品的性質(zhì)和注意事項，預(yù)測實驗結(jié)果。

2.注意保持科學(xué)實驗的嚴(yán)肅性、嚴(yán)格性和嚴(yán)密性。實驗過程中，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真地觀察教師

的演示，嚴(yán)肅認(rèn)真地按規(guī)定步驟進(jìn)行操作。

3.仔細(xì)、耐心地觀察實驗過程中出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，及時:真實客觀地記錄實驗結(jié)果，并

積極思考，認(rèn)真分析，得出結(jié)論。

4.積極參與小組設(shè)計實驗，樹立團(tuán)隊精神，并發(fā)揮自己的聰明才智，創(chuàng)造性地開展科學(xué)

實驗。

5.實驗所用的儀器、器材和試劑須按照要求擺放，嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行操作，保證實

驗過程順利進(jìn)行，并取得預(yù)期結(jié)果。

6.要愛護(hù)公共財物，節(jié)約試劑材料，不得將實驗室任何物品私自帶走。如將儀器、器材

損壞，應(yīng)及時報告教師，并登記備案。

7.實驗室內(nèi)應(yīng)保持安靜，遵守紀(jì)律，不得高聲談笑、隨便走動、玩弄動物。

8.實驗室內(nèi)禁止吸煙、進(jìn)食、飲水、用嘴習(xí)習(xí)管及濕潤標(biāo)簽，不準(zhǔn)隨地吐痰。

9.如有傳染性材料、有毒材料流灑與桌面、地面或衣服上，或發(fā)現(xiàn)割破皮膚、被動物咬

傷等意外時，要及時報告教師，做好妥善處理。

10.實驗結(jié)束后，應(yīng)清理實驗用品，物歸原處。實驗廢棄物應(yīng)放入或倒入指定的地方或容

器內(nèi)。服從衛(wèi)生值日安排，認(rèn)真負(fù)責(zé)地做好清潔衛(wèi)生。

11.離開實驗室前應(yīng)洗手，注意關(guān)好水、電、門、窗等。

12.認(rèn)真填寫實驗記錄，按時提交實驗報告。

第一章基礎(chǔ)性試驗

實驗一免疫血清的制備

免疫血清是機體受到抗原物質(zhì)刺激后的血清，含有特異性免疫球蛋白?？芍苯討?yīng)用于病

原的診斷或感染性疾病的緊急預(yù)防和治療:也可通過純化血清中的免疫球蛋白來制作多種與

免疫相關(guān)或不相關(guān)疾病的診斷和治療制劑。免疫血清又稱抗血清或抗體，而從抗血清中純化

的免疫球蛋白則只能稱為抗體。在傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法中，尤其是作細(xì)菌的血清學(xué)鑒定時，抗

血清即能滿足要求，無需純化，因為純化的過程將造成免疫球蛋白的丟失。但在現(xiàn)代免疫學(xué)

方法中，由于免疫標(biāo)記和反應(yīng)精確度的需要，必須純化抗血清的有效成分，即獲得免疫球蛋

白甚至是某一類或亞類的免疫球蛋白。

抗體的制備大致包括三個階段，即抗原的制備與純化、動物免疫和血清分離純化與鑒定。

抗原是制備抗體的先決條件，要制備高質(zhì)量的抗體，必須首先獲得特異性高的抗原性物質(zhì)。

抗體制備的方案視抗原的性質(zhì)不同而異。

【目的要求】

本實驗制備抗人全血清和傷寒沙門菌0抗體,要求掌握免疫血清制備的原理及其方法步

驟。

【實驗原理】

用抗原刺激機體可以使機體產(chǎn)生抗體，抗原與抗體是一對概念，抗原的純度和活性，影

響著其免疫動物后獲得的抗體的特異性和滴度。根據(jù)抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律，視抗原的性質(zhì)選

擇不同的途徑免疫動物，經(jīng)初次、再次免疫的過程，使得動物血清中產(chǎn)生足量的特異性抗體,

繼而分離血清并純化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗體。

【器材試劑】

1.抗原與免疫對象細(xì)菌菌種（傷寒沙門菌0901）、混合人全血清、健康家兔。

2.福氏佐劑①福氏不完全佐劑：稱取羊毛脂5g,逐滴加入石蠟油20ml（羊毛脂:石蠟

油可為1:1?1:4）,高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩＂诟Ｊ贤耆魟河诓煌耆魟┲屑尤肟ń?/p>

苗2?20mg/ml,研缽中研磨乳化后即為完全佐劑，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.生理鹽水、麥?zhǔn)媳葷峁堋⒏视?、防腐劑?.02%疊氮鈉或0.01%硫柳汞）等。

4.剪刀、鑲子、注射器、研缽、試管等器材和冰箱、離心機等儀器。

【方法步驟】

1.傷寒沙門菌0抗體的制備

⑴傷寒沙門菌0抗原的制備：經(jīng)革蘭染色作細(xì)菌純度鑒定的傷寒沙門菌0901,密集劃

線接種于普通瓊脂平板（若需大量制備，可接種于用柯氏瓶制備的瓊脂培養(yǎng)基），37℃培養(yǎng)

24?48h后，用生理鹽水將細(xì)菌菌苔洗于清潔、無菌的三角燒瓶中，置60℃水浴或隔水煮沸

lh以破壞細(xì)菌的鞭毛，用濾紙過濾（大量制備時）或移入離心管4000r/min離心10?20min

（少量時）。將濾過的菌液接種少量于瓊脂平板進(jìn)行無菌試驗（37℃,24h）,確定無菌后

用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至10"個/ml,此為細(xì)菌0抗原，置4c保存?zhèn)溆?。若制備鞭毛抗?

則可用含有5%石炭酸（苯酚）的生理鹽水洗下瓊脂平板上的菌苔，37℃溫育48h后作無菌

試驗，濾過后用生理鹽水配成一定濃度。

⑵傷寒沙門菌0抗原免疫方案：用于免疫動物的菌液濃度視菌種的不同而異，傷寒沙

門菌、志賀痢疾菌等腸道桿菌，免疫濃度多為109個/ml左右。細(xì)菌性抗原的免疫方案大致相

同，見表1—1

表1—1傷寒沙門菌。抗原的免疫方案

免疫日期（天）免疫途徑抗原免疫劑量（nil）

1多點皮內(nèi)傷寒沙門0抗原1.0

6靜脈傷寒沙門0抗原0.5

11靜脈傷寒沙門?？乖?.5

16靜脈傷寒沙門0抗原1.0

19靜脈傷寒沙門?？乖?.0

⑶試血：末次免疫7d后即可試血，耳靜脈或心臟采血，分離血清與傷寒沙門菌0抗原

作試管凝集試驗，凝集效價（滴度）在1:1600?3200之間時即可放血，若效價較低可繼續(xù)加

強免疫。

（4）放血：勁動脈放血（也可心臟采血），以最大限度的獲得血清。

2.抗人全血清的制備

⑴抗原-福氏完全佐劑：取混合人全血清，用生理鹽水作1:4稀釋。將稀釋血清按與完

全佐劑1:1體積的比例混合，制成油包水狀態(tài)。具體方法如下：

1）研磨法：取完全佐劑置于無菌研缽中，然后逐滴加入稀釋混合人血清，邊加邊研磨，

直至滴一滴至水中不散開為止，此即完全乳化的油包水狀態(tài)。若系不完全佐劑，則像加入人

全血清那樣，按2~20mg/ml的量加入卡介苗。

2）注射器法：即用兩個注射器對接，使佐劑與抗原往返推拉，以至乳化。另外，也可將

佐劑置磁力攪拌器上，邊攪拌，邊滴加抗原并繼續(xù)攪拌，使其完全乳化。

⑵抗原-福氏完全佐劑免疫動物：取健康家兔，用剪刀減去家兔雙后足足掌的毛，碘酒

和酒精棉球消毒。每只足掌注射抗原-福氏完全佐劑0.5ml,每只家兔注射量1ml。兩周后，

再于胴窩淋巴結(jié)內(nèi)注射抗原-福氏完全佐劑，每側(cè)注射量仍為0.5ml。

⑶無佐劑的人血清加強免疫：上述免疫周后，耳靜脈注射人血清（1:2稀釋）0.5ml

左右以加強免疫,如此重復(fù)1?2次，并于最后一次注射一周后采血。

（4）試血：采血方法同傷寒沙門菌0抗血清制備。試血時，環(huán)狀沉淀測定的抗體效價達(dá)到

1:5000,雙向瓊脂擴(kuò)散試驗效價達(dá)到1:16以上即可放血收集血清。如效價不夠，可追加免疫。

⑸抗血清采集：頸動脈放血或心臟采血獲得的兔血，置37c促進(jìn)血塊收縮，并用毛細(xì)

吸管吸取血清，經(jīng)3000r/min離心去除殘留的紅細(xì)胞。

3.抗血清的鑒定獲得的免疫血清需要進(jìn)行特異性檢測、親和力測定和效價滴定。針

對顆粒性抗原的免疫血清效價，可通過凝集或溶細(xì)胞試驗（如溶血素效價滴定）檢測?？扇?/p>

性抗原相應(yīng)抗體的效價和純度多選用環(huán)狀沉淀、瓊脂擴(kuò)散和免疫電泳的方法檢測。酶免疫測

定、放射免疫分析及平衡透析等方法，可用于抗體的特異性和親和力測定。抗血清鑒定的方

法詳見后述相應(yīng)實驗。

4.抗血清的純化更加精細(xì)的免疫試驗需要從抗血清中提取免疫球蛋白，此過程稱為

抗血清的純化。純化的步驟為：50%飽和硫酸鉉鹽析以沉淀血清球蛋白，應(yīng)用透析或分子篩

法除鹽。除鹽后的球蛋白過陰離子交換柱（DEAE-纖維素），根據(jù)不同類別免疫球蛋白的等

電點，選用不同pH和離子強度的緩沖液分別洗脫之；高滲或風(fēng)于法濃縮免疫球蛋白，若使

用冷凍干燥器則可獲得干燥制品。

5.抗血清的保存抗體的保存以濃度20?30mg/ml為宜，加入萬分之一的硫柳汞或千

分之一的疊氮鈉防腐，并加入等量的中性甘油，分裝小瓶，一20以下保存，數(shù)月至數(shù)年內(nèi)抗

體效價無明顯改變。

【結(jié)果分析】

抗原免疫動物后獲得的抗血清，效價可用上述相應(yīng)試驗判斷；其特異性則可通過雙擴(kuò)，

免疫電泳或交叉凝集試驗進(jìn)行考察。各試驗結(jié)果的觀察和判斷參見響應(yīng)單元。此外，抗血清

的外觀應(yīng)該為澄清，力求無溶血。無血液有型成分殘留和無細(xì)菌等微生物污染。

【注意事項】

1、動物的選擇免疫血清的制備多選用家兔為免疫對象，若系大量制備或二抗種屬特

異性的需要，也可選用羊或馬。應(yīng)用的動物必須健康，且以雄性為佳。為了避免個體差異，

每種抗原最好免疫3只以上動物。

2.抗原的準(zhǔn)備全血清抗愿應(yīng)該選擇3人以上混合血清，以避免個體差異性；血清應(yīng)新

鮮，以保持血清中各成分的活性。在細(xì)菌性抗原制備過程中，應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，保證其純度

和避免對實驗者的感染。

3.佐劑的準(zhǔn)備與使用佐劑應(yīng)用于可溶性抗原的免疫，顆粒性抗原的免疫無需佐劑。

佐劑與抗原混合研磨時，應(yīng)充分乳化，否則難以達(dá)到預(yù)期的免疫效果。在使用佐劑-抗原時,

若難以吸入注射器，則可將連同裝有佐劑的容器置熱水上加熱，并選用較粗的注射針頭。注

射完畢后，剩余佐劑-抗原置4保存。

4.免疫程序并非固定不變，一般而言，不與佐劑一同免疫的抗原，免疫間隔時間較短,

可每隔2?3天免疫一次。由于佐劑具有緩釋作用，于佐劑一起免疫的抗原可隔1?2周。無論

有無佐劑，最后一次免疫一周后采取血清。加強免疫的劑量一般為首次劑量的1/5?2/5。如

需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫；若欲得到高效價的抗血清，則宜

采用大劑量抗原長程免疫。由于免疫期限及間隔時間較長，要注意脫敏，尤其在進(jìn)行靜脈免

疫時。脫敏的原則是少量多次注射抗原，例如，在靜脈注入抗原前，先將抗原少量注入腹腔,

lh后再作緩慢靜脈注射。

實驗二凝集反應(yīng)

細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，當(dāng)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在的條件下，

可逐漸聚集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原

(agglutinogen),抗體稱為凝集素(agglutinin反應(yīng)過程可分為兩階段：①抗原抗體的特

異結(jié)合；②出現(xiàn)可見的顆粒凝集。

凝集試驗既是一個定性的檢測方法，即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽性或陰性：

也是一個半定量的檢測方法，即將標(biāo)本作一系列對倍稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最

高稀釋度作為滴度。由于凝集反應(yīng)方法的便，敏感度高，因而在臨床檢驗中被廣泛應(yīng)用。

凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩大類。

通過以下實驗的實踐，掌握各種凝集反應(yīng)的原理，熟悉方法步驟、結(jié)果判斷以及注意事

項。

一直接凝集反應(yīng)

直接凝集(directagglutination)反應(yīng)是指細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適量電解質(zhì)

參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。

(-)玻片凝集試驗

【實驗原理】

玻片凝集試驗(slideagglutinationtest)多用作定性試驗。?般是用1滴已知診斷血清與

1滴受檢菌液或細(xì)胞懸液，在玻片上混勻后，短時間內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果。出現(xiàn)顆粒凝集的為

陽性反應(yīng)。此法簡便、快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型。也常用于

紅細(xì)胞ABO血型的鑒定。

【器材試劑】

1.標(biāo)本任一常見細(xì)菌的平板或斜面培養(yǎng)物；待測血清

2.試劑與細(xì)菌相對應(yīng)的診斷血清(可用生理鹽水作適當(dāng)稀釋，以免發(fā)生前帶現(xiàn)象)、

生理鹽水、已知沙門傷寒菌菌體抗原懸液(7X108/ml)＞傷寒沙門菌0抗血清。

方法步驟(以鑒定待測標(biāo)本中的細(xì)菌為例)

1、取潔凈玻片1張，用蠟筆劃分為左右2格。

2、用接種環(huán)按無菌操作取生理鹽水和已知診斷血清各2環(huán)分別置于左右格內(nèi)。

3、用接種環(huán)取標(biāo)準(zhǔn)菌液少許于左格生理鹽水中混勻，

4、滅菌接種環(huán)，同樣方法取待檢菌液少許于右格診斷血清并混勻。

5、將玻片輕輕晃動，室溫下觀察結(jié)果，

【結(jié)果分析】

生理鹽水對照測不出現(xiàn)凝集，為均勻混濁的乳狀液。在診斷血清中，細(xì)菌與相應(yīng)抗體反

應(yīng)會出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，為陽性結(jié)果。如與對照測相同不發(fā)生凝集則為陰性。

【注意事項】

1.每一待檢菌均需作生理鹽水對照，以排除當(dāng)細(xì)菌發(fā)生S—R變異時的細(xì)菌自凝，保

證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.在載波片兩端涂布細(xì)菌時，應(yīng)先涂生理鹽水一側(cè)，后涂診斷血清一側(cè)，以免將血清

誤帶入生理鹽水一側(cè)

3.試驗后的細(xì)菌仍有傳染性，應(yīng)將玻片放入消毒缸內(nèi)

4.若作ABO血型鑒定，室溫過低(一10℃以下)可出現(xiàn)冷凝集，造成假陽性結(jié)果。

5.嚴(yán)格無菌操作。

(二)試管凝集試驗

試管凝集試驗(tubeagglutinationtest)為半定量試驗，在微生物學(xué)檢驗中常用已

知細(xì)菌作為抗原液與?系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，通常以

產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價(titer),亦稱為滴度。在試驗中，

由于電解質(zhì)濃度和pH不適當(dāng)?shù)仍?，可引起抗原的非特異性凝集，出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此

必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對照組。

臨床上常用的直接試管凝集試驗為肥達(dá)試驗(Widaltest)和外斐試驗(Weil-Felix

test)。在輸血時也常用于受體和供體兩者的紅細(xì)胞和血清的交互配血試驗。

(方法步驟見肥達(dá)試驗)

二間接凝集反應(yīng)

將可溶性抗原(或抗體)先吸附于適當(dāng)大小的與免疫特異性無關(guān)的顆粒性載體的表面，

形成人工的免疫微球(或致敏載體)，然后與相應(yīng)抗體(或抗原)作用，在適宜的電解質(zhì)存

在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)(indirectagglutination)或被動凝集反

應(yīng)(passiveagglutination)。這種反應(yīng)適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測，其敏感度高于沉

淀反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗。

(-)間接血凝試驗

【實驗原理】

血凝試驗(hemagglutinationtest)是紅細(xì)胞凝集試驗的簡稱。間接血凝試驗(indirect

hemagglutinationtest)是將可溶性抗原(細(xì)菌的提取液等)吸附于紅細(xì)胞成為抗原致敏紅細(xì)

胞，這種“致敏紅細(xì)胞”與相應(yīng)抗體作用可產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象(圖2—1)。以測定傷寒血

清抗體滴度為例敘述如下：

抗體

圖2—1間接血凝試驗原理示意圖

【器材試劑】

I.傷寒桿菌“0”抗原

2.傷寒桿菌。901免疫兔血清。

3.2%綿羊紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、試管、吸管、37℃水浴箱。

4.“0”抗原的制備：將傷寒桿菌0如接種于柯氏瓶，37℃培養(yǎng)18?24h,用生理

鹽水洗下菌苔配制成每毫升含100億細(xì)菌的懸液，置100℃水中2h,離心沉淀，吸取上清液分

裝于無菌試管，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5.致敏紅細(xì)胞懸液制備：取一定稀釋度的抗原（應(yīng)事先滴定）加等量2%綿羊紅細(xì)

胞懸液，混合后放入37℃水浴箱中，每隔15min取出振搖1次，共經(jīng)2h,然后取出，用生理

鹽水洗滌3次，再配制成0.25%懸液即成。

【方法步驟】

1.取小試管10支，排于試管架上，于第1管中加入生理鹽水0.9ml,其余各管加0.25ml。

2.以吸管吸取已加熱滅活的免疫血清0.1ml,加入第1管，混勻后吸取0.75mL于第2

管中加0.25ml,余下0.5ml棄去。

3.將第2管血清與鹽水混合后，吸取0.25ml至第3管。如此依次稀釋到第9管，自第9

管中吸出0.25ml棄去。第10管不加血清留作對照。

4.于每管加入等量已致敏的0.25%綿羊紅細(xì)胞懸液，混勻后放入37℃水浴中2h觀察結(jié)

果。

【結(jié)果分析】

凡紅細(xì)胞沉積于管底，集中呈一圓點的為不凝集（一）。如紅細(xì)胞凝集，則分布于管底

周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強弱（圖2—2）,以++凝集的孔為滴度終點。

++++++++++,+++

圖2-2血凝反應(yīng)強度示意圖

-：紅細(xì)胞沉積于管底；

+：紅細(xì)胞沉積于管底，周圍有散在少量凝集；

++:紅細(xì)胞形成層凝集，面積較小，邊緣較松散；

+++:紅細(xì)胞形成片層凝集，面積略多于++;

++++:紂細(xì)胞形成片層凝集，均勻布滿孔底，或邊緣皺縮如花邊狀

呈現(xiàn)明顯血凝（++）試管中免疫血清的最高稀釋倍數(shù)，即為該血清的間接血凝效價。

【注意事項】

參照反向間接血凝試驗

（二）反向間接血凝試驗

【實驗原理】

把純化的抗體吸附于醛化紅細(xì)胞上，即制成抗體致敏的紅細(xì)胞，它能與相應(yīng)可溶性抗原

結(jié)合，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，此即反向間接血凝試驗（reverseindirecthemagglutinationtest）（圖

2-3）o常用于檢查HBsAg、甲胎蛋白、新型隱球莢膜抗原等可溶性抗原。

圖2—3反向間接血凝示意圖

【器材試劑】

1.1:20抗-HBs致敏的醛化紅細(xì)胞，純化的1:20抗-HBs,待檢血清，稀釋液。

2.配制致敏紅細(xì)胞懸液：于每瓶凍干診斷紅細(xì)胞加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻紅

細(xì)胞懸液，濃度約為0.6%。

3.“V”型微量血凝板，0.025稀釋棒，微量攪拌器，刻度吸管，滴管（40滴/ml）。

【方法步驟】（試驗加樣程序見表2—1）

1.在“V”型血凝板上，每份待檢血清設(shè)立8孔，于各孔內(nèi)用40滴/ml滴管各加1滴稀釋

液（相當(dāng)于0.025ml）。

2.用0.025ml容量的稀釋棒蘸滿待檢血清分別依次在各孔內(nèi)捻轉(zhuǎn)作倍比稀釋（一般每

孔均需捻轉(zhuǎn)10次左右），直至第7孔、第8孔為致敏紅細(xì)胞對照。另設(shè)第9孔為陽性對照，加

0.025mlHBsAg陽性血清。

3.于每孔中加入0.025ml混勻的致敏紅細(xì)胞懸液。依照表2—1

4.將血凝板置于微型振蕩器上振蕩1—2min,置37℃lh后觀察結(jié)果。

表2—1反向間接血凝試驗加樣程序

孔號123456789

生理鹽水0.025-0.025-0.025-0.025、0.025、0.025、0.025、0.0250.025

卜、卜、卜、-、丸［

1

待檢血清0.025-10.025-10.025-10.02510.025J0.02510.0251陽性血清

致敏紅細(xì)胞0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025

血清稀釋度1:41:81:161:321:641:1281:256紅細(xì)胞陽性

對照對照

37℃h觀察結(jié)果

【結(jié)果分析】

不凝集：紅細(xì)胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點。

明顯凝集（++）:紅細(xì)胞于孔底形成薄膜狀凝集，中央可見疏松的紅點。

出現(xiàn)明顯凝集的血清最高稀釋度即為HbsAg效價,凡效價＞1:16者需進(jìn)一步做中和試驗。

中和試驗：在血凝板上每份標(biāo)本設(shè)測定排與對照排，每排8孔，于每孔加稀釋液

0.025ml,用2只稀釋棒蘸取被檢血清，分別在第2排作倍比稀釋至第7孔，第8孔不含血清，

為紅細(xì)胞對照。然后，于測定排各孔加稀釋液0.025mL對照排各孔加1:20抗-HBs0.025ml。1-

2min后，血凝板置37℃30min。取出，于各孔加0.025ml致敏紅細(xì)胞振搖混勻，置37℃lh后

觀察結(jié)果。

【注意事項】

1.致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時間短，且易變脆、溶血和污染，所以配制的致敏紅細(xì)胞懸

液一般在當(dāng)天用完，若置2?10℃,使用期不超過3do若想長期保存而不溶血，可在致敏前

先將紅細(xì)胞醛化。常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。紅細(xì)胞經(jīng)醛化后體積略有增大,

兩面突起呈圓盤狀。

2.試驗用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。

3.血凝板、稀釋棒用后均需用體積分?jǐn)?shù)為10%次氯酸鈉浸過夜；滴管需煮佛lOmin,然

后用水沖凈，再用蒸偲水沖洗，晾干備用。

4.致敏用的抗原或抗體要求純度高，并保持良好的免疫活性。

（三）膠乳凝集抑制試驗

在呈陽性反應(yīng)的乳膠集凝試驗中，若先將待測抗原（抗體）與已知的抗體（抗原）混合,

隔一定時間后再加入抗原（抗體）致敏的乳膠顆粒，此時，通過觀察原有的陽性試驗結(jié)果是

否轉(zhuǎn)陰而得出結(jié)果（圖2—4）,此為膠乳凝集抑制試驗（indirectagglutinationinhibitiontest）＜）

本次實驗以臨床上常用的檢測絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠試驗（preg-nancytesting）

為例。

Y

Y

Y

Y

［實驗原理］圖2-4間接凝集抑制試驗原理示意圖

將含有可溶性抗原的彳qMJT小/戶人JI半作匕口,7L7JI卜口再加入抗原致敏的乳膠顆

粒，因抗體已與標(biāo)本中的可溶性抗原結(jié)合，乳膠顆粒不再出現(xiàn)可見凝集現(xiàn)象。

【器材試劑】

1.HCG致敏乳膠試劑妊娠診斷試劑（有商品出售）。

2.抗HCG抗體與妊娠診斷試劑配套供應(yīng)。

3.孕婦尿液、正常人尿液、待測尿液均可臨床篩選獲得。

4.生理鹽水、黑色方格反應(yīng)板、牙簽、毛細(xì)滴管、刻度吸管、試管、水浴箱等等。

【方法步驟】

1、在黑色方格反應(yīng)板上取3個格，用毛細(xì)滴管分別加待測尿液,、孕婦尿液、正常人尿

液（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，分別用牙簽混勻后連續(xù)搖動1?2min。

2、于上述3格每格加HCG致敏乳膠試劑1滴，分別用牙簽混勻后，連續(xù)搖動2?3min后

觀察結(jié)果。

【結(jié)果分析】

如試驗格出現(xiàn)明顯凝集為陰性反應(yīng)，即HCG陰性；不出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，即

HCG陽性。

【注意事項】

1、乳膠抗原使用前一定要搖勻。

2、放置時間不應(yīng)過長，一般不超過5min。

3、注意不出現(xiàn)凝集為陽性，出現(xiàn)凝集為陰性。

4、測定HCG時最好取晨尿，待測標(biāo)本如試劑的加入順序應(yīng)遵守規(guī)定的步驟，否則無

法判斷結(jié)果。

（四）金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗

【實驗原理】

金黃色葡萄的細(xì)胞壁成分中，含有一種稱為A蛋白的抗原物質(zhì)（SPA）能與人及多種哺

乳動物IgG的Fc段發(fā)生非特異性結(jié)合，因此可利用金黃色葡萄球菌為載體吸附IgG。當(dāng)SPA

與IgG相應(yīng)結(jié)合后有抗體活性的Fab段暴露于SPA菌表面，此時若有與該IgG相應(yīng)的特異

性抗原存在時,則可發(fā)生凝集反應(yīng),即為金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗（staphylococcal

proteinAcoagglutinationtest）（圖2—5）。本試驗是反向間接凝集試驗的一種，箱異性及敏

感性均高，主要用于檢測可溶性微量抗原。

圖2-5協(xié)同凝集試驗原理示意圖

【器材試劑】

1、流行腦膜炎病人腦脊液（用前經(jīng)煮沸處理2min,并適當(dāng)稀釋）。

2、A群腦膜炎球菌家兔免疫血清（用前經(jīng)56℃30min滅活）。

3、SPA菌穩(wěn)定液。制備過程為：選取能產(chǎn)生SPA的金黃色葡萄球菌CowanI株接種在

瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃孵育18—'24h,。用少量PBS洗下菌苔，以3000r/min離心30min,

其沉淀物用PBS洗2次，然后以含0.5%福爾馬林O.Olmol/LPBS制成10%懸液，置室溫作用6h

或過夜。再將此懸液加熱56℃30min,迅速冷卻，再以PBS洗3次,最后用含0.05%—0.1%NaN3

的PBS制成10%懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4、抗體標(biāo)記SPA菌的制備將SPA菌穩(wěn)定液用PBS洗1次后，再用PBS制成2%的懸

液，用PBS將免疫血清稀釋成適宜濃度，一般可將測定合適的稀釋度減少半倍（如適宜濃

度為1:8,則實際應(yīng)用為1:6）。將2%SPA菌穩(wěn)定液與稀釋免疫血清等量混合，置37℃水浴中

30min（也可置4C冰箱過夜）。取出混合液后，以3000r/min離心30min,棄上清，其沉淀物

用PBS洗2次，然后用含0.05%?0.1%NaN3，制成2%懸液，放4℃冰箱保存?zhèn)溆?，一般可?/p>

存1個月左右，其敏感性不變。

【方法步驟】

I.取潔凈玻片1張，將其分為3大格，第1格及第2格先各加1滴抗體標(biāo)記SPA菌液，第3

格加1滴未經(jīng)抗體標(biāo)記的葡萄球菌菌液。

2.然后第1格及第3格各加I滴病人腦脊液，第2格加1滴生理鹽水。

3.分別用牙簽混合均勻并不斷搖動玻片，在日光燈下觀察結(jié)果，一般在幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)

反應(yīng)。分析各格反應(yīng)有何不同，并作出判斷。

【結(jié)果分析】

第1格內(nèi)形成白色凝集物，第2、3格內(nèi)無凝集。

【注意事項】

1、用前仔細(xì)檢查試劑本身有無自凝顆粒。

2、本試驗的特異性取決于標(biāo)記用抗血清的特異性，凝集反應(yīng)的強弱取決于抗血清的效

價高低，故應(yīng)選用特異性強和效價高的抗血清

實驗三沉淀反應(yīng)

-環(huán)狀沉淀實驗

【目的要求】

要求掌握實驗原理，熟悉其方法步驟，了解其檢測意義。

實驗原理

可溶性抗原（如血清、細(xì)菌浸出液、毒素等）和相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下可發(fā)生結(jié)合，

經(jīng)過一定的時間，在二者比例適當(dāng)時形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)（precipitation）。

環(huán)狀沉淀實驗是把可溶性抗原小心加入已含抗體溶液的環(huán)狀沉淀管液面上，當(dāng)對應(yīng)的抗原與

抗體相遇，在二者交界面處可出現(xiàn)乳白色環(huán)狀沉淀物，即為環(huán)狀沉淀陽性反應(yīng)。

【器材試劑】

1.標(biāo)本人待檢血清

2.試劑稀釋雞血清、抗人血清、生理鹽水

3.器材沉淀小管（內(nèi)徑1.5~3mm）或小試管、毛細(xì)吸管、試管架等

【方法步驟】

1.取3支沉淀小管，排列于試管架并作好標(biāo)記；

2.在1號、2號兩支試管內(nèi)分別加入抗人血清0.4ml,3號試管內(nèi)加入0.4ml生理鹽水作為

對照；

3.再在1號、3號試管內(nèi)分別加入人待檢血清0.2ml,2號試管內(nèi)加入雞血清0.2ml：

4.室溫靜置10分鐘，觀察結(jié)果。

【結(jié)果分析】

L1號試管兩液面交界處出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)，為環(huán)狀沉淀試驗陽性，2號和3號試管為陰

性。

2.由于沉淀反應(yīng)抗原多系膠體溶液，沉淀物主要是山抗體蛋白所組成，為求得抗原與

抗體的適宜比例，故操作中通常是稀釋抗原而不稀釋抗體，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)

的效價。

3.本試驗常用于抗原的定性試驗，如診斷炭疽的Ascoli試驗、血跡的鑒別等。

【注意事項】

1.加抗原時應(yīng)使沉淀管傾斜，使其緩慢由管壁流下，輕浮于抗體上面，勿使相混，避

免氣泡產(chǎn)生。

2.觀察結(jié)果時將沉淀管平放在眼前，如在沉淀管后面襯以黑紙或手指，使光線從斜上

方射入兩液面膠結(jié)處，則能更清楚地看到沉淀環(huán)。

二雙向免疫擴(kuò)散試驗

【目的要求】

要求掌握試驗原理、結(jié)果分析，熟悉其方法步驟。

【實驗原理】

將對應(yīng)的抗原與抗體放在瓊脂凝膠板中的相應(yīng)孔內(nèi)，讓二者在凝膠中自由擴(kuò)散。當(dāng)二者

相遇忖發(fā)生特異性反應(yīng)，在濃度比例合適處形成可見的白色沉淀線。若同時含有多種抗原抗

體系統(tǒng)，根據(jù)抗原與抗體的性質(zhì)、純度和比例的不同，沉淀線的形狀、位置和數(shù)量不一。

【器材試劑】

1.標(biāo)本待檢人血清、陽性對照血清。

2.試劑羊抗人IgG診斷血清、15g/L鹽水瓊脂等。

3.器材載玻片、吸管、打孔器、濕盒、微量加樣器等。

【方法步驟】

I.澆板用粗孔吸管吸取熔化的15g/L鹽水瓊脂4.5ml,澆注于潔凈載玻片上，要均勻、

平整、無氣泡、布滿整個玻片。

2.打孔待瓊脂凝固后，用直徑3mm的打孔器打孔，使孔間距為4~5mm。臨床常用

的孔型為梅花形，中間為抗體孔，四周等距排列6個抗原孔。

3.加樣用微量加樣器向中央孔加入抗體（羊抗人IgG診斷血清），周圍孔加入待測

抗原，其中第1、4孔加入陽性對照血清，第2、3、5、6孔分別加入不同的待檢血清。如用于

檢測抗體特異性時，中央孔加抗血清，四周孔加入不同的有關(guān)抗原。如進(jìn)行抗體效價滴定時，

則在中央孔加入抗原，四周孔加入不同稀釋的抗血清。

4.擴(kuò)散將加好樣的瓊脂板放入濕盒中（內(nèi)有5moi/L的石炭酸紗布），置室溫或

37℃l~2d,于24h和48h各觀察和記錄結(jié)果一次。

【結(jié)果分析】

1.如果凝膠中出現(xiàn)白色沉淀線，說明抗原與抗體相對應(yīng)。若抗原與抗體只含單?的成

分則形成一條沉淀線；若含多種成分，可形成多條沉淀線。沉淀線的位置因抗原和抗體的分

子量、濃度比例、擴(kuò)散速度等因素不同而異。另外，若相臨抗原濃度相等，可出現(xiàn)對稱相融

的沉淀線；若不等，沉淀線移向低濃度一邊。

2.在梅花孔型中，若相臨兩條沉淀線完全融合，說明兩抗原部分相同；若相臨沉淀線

發(fā)生交叉，說明兩抗原完全相同。

3.陽性結(jié)果多在24h以內(nèi)出現(xiàn)，48h不出現(xiàn)沉淀線可判為陰性結(jié)果。放置過久可使沉

淀線消失。

4.此方法簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠；但靈敏度低，試驗所需時間長，且只能定性，不

能定量，僅適用于大量普查項目。

【注意事項】

1.所用載玻片要潔凈、邊緣無破損，否則難以澆制瓊脂板。

2.緩沖瓊脂的溫度要適宜，溫度過高澆板時易外溢，同時表面蒸發(fā)量大，瓊脂板光潔

度差；但溫度過低則瓊脂凝固過快，制板厚度不均勻，表面不光滑。

3.澆制瓊脂板時動作要迅速，過于緩慢容易邊加邊凝，使瓊脂板凹凸不平。

4.打孔時要小心，勿使瓊脂層脫離載玻片或瓊脂板底層開裂，以免加樣時順裂縫或底

部散失。一旦出現(xiàn)裂縫或脫離現(xiàn)象，可向孔內(nèi)滴加少許溫瓊脂加以彌補或?qū)傊逶诨鹧娓?/p>

處來回通過幾次補底。

5.為了使沉淀線保持清晰度，可在加樣完畢將瓊脂板置37℃下進(jìn)行擴(kuò)散，形成沉淀線

后置室溫或4℃冰箱為佳。

三單向免疫擴(kuò)散試驗

【目的要】求

要求掌握試驗原理、熟悉試驗方法及結(jié)果分析，了解其臨床意義。

【實驗原理】

將一定量抗體混勻于瓊脂凝膠內(nèi)，凝膠孔中加入抗原，抗原向四周擴(kuò)散的過程中與凝膠

中的抗體發(fā)生反應(yīng)，在抗原與抗體比例合適處形成抗原抗體復(fù)合物，呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)。沉淀

環(huán)直徑的大小與孔中抗原濃度成正比。如預(yù)先用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，可

從己知的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中抗原的含量。

【器材試劑】

1.標(biāo)本待檢人血清、免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)（IgG含量10mg/ml）。

2.試劑羊抗人IgG診斷血清（單擴(kuò)效價1：60）、15g/L鹽水瓊脂。

3.器材三角燒瓶、載玻片、打孔器、吸管、滴管、濕盒、水浴箱、微量加樣器和半

對數(shù)坐標(biāo)紙等。

【方法步驟】

1.瓊脂準(zhǔn)備吸取已熔化瓊脂59ml于三角燒瓶中，置56c水浴保溫，將預(yù)溫的羊抗人

IgG診斷血清1ml與瓊脂充分混合，繼續(xù)保溫于56℃?zhèn)溆?。如果羊抗人IgG診斷血清的單擴(kuò)

效價不是1:60,試驗時所需瓊脂量與抗體量的比例應(yīng)加以調(diào)整。

2.澆板取混有抗血清的瓊脂液4.5ml澆注于載玻片上，注意澆板要均勻、平整、無

氣泡、布滿整張裁玻片。

3.打孔待瓊脂凝固后，用打孔器打孔，孔徑3.5mm,孔距1072mm。孔要打得圓整

光滑，邊緣不要破裂，底部不要與載玻片脫離。如有脫離應(yīng)注意補底。

4.加樣將待檢血清用生理鹽水做1：40稀釋，用微量加樣器取稀釋血清10口1加入相

應(yīng)的試驗孔內(nèi)，每份標(biāo)本加兩孔。如同時測定多個標(biāo)本，注意做好標(biāo)記，認(rèn)真記錄，不要搞

混。

另外，取免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)1支加0.5ml蒸儲水溶解，用生理鹽水稀釋成如下濃度：

1：10、1：16、1：20、1：32、1：40,分別加入另一套孔中，每孔中加10u1,用于制備標(biāo)

準(zhǔn)曲線。

5.擴(kuò)散將加樣完畢的瓊脂放于濕盒中，置室溫或37℃24h后觀察結(jié)果。

6.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以各稀釋度工作標(biāo)準(zhǔn)的沉淀環(huán)直徑為橫坐標(biāo)，相應(yīng)孔中IgG含量為

縱坐標(biāo)，在半數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【結(jié)果分析】

1.精確測量各試驗孔沉淀環(huán)直徑，如果沉淀環(huán)不太圓，則取最大直徑和最小直徑的平

均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相對應(yīng)的IgG含量，乘以稀釋倍數(shù)，即為待檢血清中IgG的實際

含量。

2.瓊脂單擴(kuò)散試驗為定量測定法，常用于血清中IgG、IgA、IgM、補體、白蛋白、蛋

白酶等物質(zhì)的定量測定，為臨床診斷提供參考指標(biāo)。

3.本方法比較穩(wěn)定，易于操作；但觀察結(jié)果需時間長，敏感度偏低，每次試驗均需做

參考血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【注意事項】

1.澆制瓊脂板的事項同凝膠雙擴(kuò)散試驗。

2.每批試驗均應(yīng)同步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。即檢測待檢血清所用瓊脂板應(yīng)和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線采

用的瓊脂板為同一批瓊脂板。

3.瓊脂熔化后置水浴中保溫時，溫度不可超過56℃,否則會使抗體變性；溫度也不可

過低，否則瓊脂易凝固而不能澆制出很好的瓊脂板。

四對流免疫電泳

【目的要求】

本實驗以測定血清中AFP為例，要求掌握實驗原理、熟悉操作過程和結(jié)果分析：了解

臨床應(yīng)用及意義。

【實驗原理】

對流免疫電泳實質(zhì)上是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙擴(kuò)散技術(shù)的結(jié)合。在偏堿性的緩沖

液環(huán)境和適當(dāng)?shù)闹绷麟妶鲋?，大部分抗原帶有較多的負(fù)電荷，電泳力大于電滲力，向正極移

動；而抗體（尤其是IgG）在同樣的環(huán)境中帶負(fù)電荷較少，而且其分子量又較大，加上凝膠

內(nèi)較強的電滲作用，故抗體電泳力小于電滲力，向負(fù)極移動。試驗中將抗原放負(fù)極，抗體放

正極，在定的時間內(nèi)（約30~90min）,移動的抗原與抗體在兩孔間相遇并發(fā)生反應(yīng)，在濃

度比例適當(dāng)時形成沉淀線。

【器材試劑】

1.標(biāo)本待測人血清、陽性對照血清。

2.試劑AFP診斷血清、pH8.60.05mol/L巴比妥緩沖液、15g/L瓊脂（用pH8.6

0.05mol/L巴比妥溶液配制）。

3.器材電泳槽、電泳儀、孔型模板、打孔器、載玻片、吸管、微量加樣器、吸球、

濾紙或紗布條等。

【方法步驟】

1.制板用粗孔吸管吸取已熔化好的巴比妥瓊脂4.5ml加到潔凈載玻片上澆制成瓊脂

板。

2.打孔待瓊脂凝固后成對打孔，孔徑為3mm,孔距為5mm。

3.加樣做好抗原和抗體的標(biāo)記（例如在無關(guān)緊要的邊緣打一小孔等），按標(biāo)記分別加

入抗原、抗體及陽性對照。

4.電泳將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，抗原孔置陰極端，抗體孔置陽極端，

電泳槽內(nèi)加0.05mol/LPH8.6的巴比妥緩沖液，液面至槽高2/3處，瓊脂板兩端用濾紙條或紗

布條與緩沖液相連。接通電源，控制電流強度在2.5~3.5mA/cm板寬。電泳30~90min后切斷

電源，取出瓊脂板觀察結(jié)果。

【結(jié)果分析】

1.待測孔與抗血清之間出現(xiàn)沉淀線為陽性，否則為陰性。

2.陽性結(jié)果的沉淀線位置與抗原和抗體分子的電荷情況有關(guān)，也與抗原和抗體的濃度

比例有一定關(guān)系。

3.對流免疫電泳實際上是電場作用下的瓊脂雙擴(kuò)散試驗，操作簡便，觀察結(jié)果快，敏

感度比瓊脂雙擴(kuò)散法高8~16倍。制作瓊脂板時必須選擇高電滲作用的普通瓊脂，還要選擇高

特異性、高親和力的抗體，否則結(jié)果難以解釋。

4.該方法可用于抗原的半定量測定或根據(jù)沉淀線的位置、形狀做抗原和抗體相對濃度

的分析。但分辯率較差，當(dāng)有多種抗原抗體系統(tǒng)存在時，形成的沉淀線常形成重疊，難以分

辯清楚，所以用作此目的時.，反倒不如瓊脂雙擴(kuò)散試驗。

【注意事項】

1.澆制瓊脂板的注意事項同瓊脂雙擴(kuò)散試驗。

2.搭橋時應(yīng)注意與凝膠接觸緊密，否則會使電流不均勻，致使沉淀線歪斜、不均勻。

3.電泳時抗原、抗體電極方向不可放反。

4.電泳時間和電流強度及孔間距有關(guān)，電泳時電流不可太大，以免蛋白質(zhì)變性，孔間

距如果較大應(yīng)適當(dāng)延長電泳時間。

5.電泳完畢，先斷電源（不僅關(guān)閉電源按鈕，一定要脫開電泳槽和電泳儀之間的連接

線，以防積蓄電壓觸電），再取出電泳板。

6.抗體或抗原要根據(jù)所標(biāo)效價做適當(dāng)稀釋，多做幾個稀釋度，選擇最適的比例關(guān)系。

五火箭電泳

【目的要求】

要求掌握火箭電泳的原理，熟悉其操作方法，了解其應(yīng)用。

實驗原理

將凝膠單擴(kuò)散的瓊脂板置人直流電場，板孔中的抗原因帶有負(fù)電荷會在含有抗體的離

子瓊脂中向正極泳動，并于比例合適處與抗體發(fā)生反應(yīng)，在泳道上形成可見的沉淀帶。泳動

中的抗原濃度越來越小，沉淀帶越來越窄，直至全部抗原與抗體結(jié)合，形成一個錐形的沉淀

峰。整個沉淀帶的形狀呈火箭樣，故名火箭電泳?？乖吭礁撸纬傻幕鸺寰驮介L。

將沉淀峰與事先用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得出標(biāo)本中抗原的含

量。

【器材試劑】

1.標(biāo)本待檢人血清、陽性血清（臍帶血清）。

2.試劑抗AFP抗體、pH8.60.05mol/L巴比妥緩沖液、精制瓊脂粉或瓊脂糖等。

3.器材電泳槽、電泳儀、打孔器、水浴箱、玻璃板、吸管、三角燒瓶和微量加樣器

等。

【方法步驟】

1.常規(guī)配制pH8.60.05mol/L巴比妥緩沖液，稱取1.5g精制瓊脂粉或瓊脂糖加到

100ml緩沖液中，在三角燒瓶內(nèi)加熱熔化。

2.將熔化好的瓊脂置56℃恒溫水浴中預(yù)溫，待溫度平衡（瓊脂膠溫度為56℃）后，將抗

AFP抗體加到瓊脂液中，二者比例為1：30。搖勻后迅速澆制瓊脂板。

3.待瓊脂凝固后在瓊脂板的一端（距板端約5mm）打孔，孔徑3mm,孔間距6?8mm,孔

的數(shù)目根據(jù)需要而定。

4.向每孔加入不同稀釋度的待檢血清，其稀釋倍數(shù)分別是5、10、20、40、80。另外，

向另一板的孔中加入系列已知濃度的陽性血清或其他抗原，用來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.電泳槽內(nèi)加入pH8.60.050101/1巴比妥緩沖液至槽高的2/3處。將加樣完畢的瓊

脂板置電泳槽的支架上，將打孔加樣端置陰極，用濾紙或紗布條將凝膠板與電泳液相連。接

通電源，調(diào)整電流強度在2?4mA/cm板寬。電泳1?2h可見火箭峰的出現(xiàn)。

6.電泳結(jié)束后，切斷電源，取下瓊脂板，如沉淀峰清晰可見，可直接判讀結(jié)果，否則

將瓊脂板浸入10g/L鞅酸生理鹽水中10分鐘，可使沉淀峰更明顯。如欲永久保留，可將瓊

脂板進(jìn)行染色干燥處理。

【結(jié)果分析】

1.首先測量已知抗原的火箭峰高度，以此為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)濃度為縱坐標(biāo)作圖，繪制

出標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品的定量可根據(jù)峰高從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。

2.火箭峰高度與孔中抗原濃度呈正相關(guān)，與凝膠中抗體濃度呈負(fù)相關(guān).但抗原濃度過

高則在瓊脂板上看不到峰頂；而抗體濃度過高則沉淀峰太低，降低試驗的敏感度。

3.沉淀峰呈尖角狀表示無游離抗原，泳動已到終點；前端呈鈍圓形或云霧狀則表示還

未到終點，應(yīng)繼續(xù)電泳。

4.用多價抗血清時每個火箭可出現(xiàn)多個子峰：抗原與抗體比例不適合或電泳條件不適

當(dāng)時不出現(xiàn)火箭峰。

5.與前述幾個電泳方法相比，火箭電泳操作簡便省時，結(jié)果重復(fù)性好，檢測靈敏度可

達(dá)0.3ug/ml?

6.如在抗原標(biāo)本中加入微量放射性核素，電泳后具有放射性的沉淀帶在暗室中可使膠

片感光，感光峰比凝膠中肉眼可見的火箭峰高得多——此法稱火箭電泳放射自顯影，檢測靈

敏度可提高40?60倍。

【注意事項】

1.凝膠單擴(kuò)散中的注意事項在此均適用，例如加入抗體時要嚴(yán)格掌握瓊脂膠的溫度，

抗原與抗體的濃度應(yīng)預(yù)先試驗。

2.應(yīng)選擇電滲作用最小的精制瓊脂粉或優(yōu)質(zhì)瓊脂糖來制備凝膠，而不用普通瓊脂。

3.打孔完畢，可先將瓊脂板放在電泳槽上，低電流通電后再加樣，加樣后立即加大電

流。這樣可防止抗原液向孔四周擴(kuò)散，使火箭峰形狀良好，敏感性增加。這一做法適用于所

有打孔加樣的凝膠電泳。使用低電壓、低離子強度、電泳時間長些，效果會更好。

4.火箭電泳適用于測定那些在pH8.6以上環(huán)境中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì),IgG、IgA等在pH8.6

條件下凈電荷幾乎等于零，因此要使IgG、IgA等在電場中也向正極泳動，應(yīng)先經(jīng)乙?；?、

甲酰化或氨甲?；幚韥碓黾铀鼈兊呢?fù)電荷。甲酰化的方法：取待檢血清若干，用0.36%甲

醛稀釋至分析要求的濃度，室溫30min,即可使蛋白質(zhì)分子中的氨基與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，

該反應(yīng)抑制了蛋白質(zhì)分子中堿性基團(tuán)的解離，使其形成某種酸，因此在pH8.6的堿性條件下

增加了其負(fù)電荷量。

六免疫電泳

【目的要求】

本試驗以鑒定人血清IgG提取物的純度為例，掌握免疫電泳的原理，熟悉操作方法，

了解結(jié)果分析及臨床應(yīng)用。

【實驗原理】

免疫電泳（immunoeletrophoresis,IEP）是瓊脂區(qū)帶電泳和凝膠雙擴(kuò)散相結(jié)合的一-種免疫

技術(shù)。試驗時先進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，將樣品中不同分子量和不同電荷的組分分離成若干區(qū)帶;

然后與電泳方向平行挖一小槽，加入含相應(yīng)抗體的免疫血清，與已分離的各抗原成分在瓊脂

中作雙向免疫擴(kuò)散。各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體形成弧形沉淀線。根據(jù)沉淀弧的位置、數(shù)

量和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。

【器材試劑】

1.標(biāo)本正常人血清、待鑒定的人IgG提取液。

2.試劑兔抗人全血清、pH8.60.05mol/L巴比妥緩沖液、12g/L瓊脂巴比妥液

凝膠、凝膠指示劑（葡萄糖0.5g和氨基黑10B0.1g溶于20ml巴比妥緩沖液中）等。

3.器材電泳儀、電泳槽、37c溫箱、恒溫水浴箱、水平臺、載玻片、吸管、3mm打

孔器、孔型樣板、尖頭棉簽棒、毛細(xì)滴管、手術(shù)刀片、濕盒等。

【方法步驟】

1.瓊脂板制備加熱熔化巴比妥瓊脂膠，用粗口吸管吸取4ml瓊脂膠，澆注到置于水

平臺上的潔凈載玻片上。凝固后按孔型樣板打孔、開槽。槽可用刀片劃制，也可用模具在澆

注前放到載玻片上；打孔開槽時要求外壁整齊，防止瓊脂破裂。制成后瓊脂板厚約L5mm,

孔徑3mm（可加樣品10u1）,槽寬1.5?2mm。

2.加樣用微量加樣器吸取正常人血清和待檢的人IgG各10口1分別加入兩個樣品孔

中，注意不要外溢。為便于觀察樣品泳動位置可在正常人血清中加微量氨基黑染液。

3.電泳將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳?？刂齐娏??4mA/cm板寬，當(dāng)?shù)鞍字甘?/p>

劑泳動至距槽端1.0cm時，可終止電泳（約1.5h）。

4.雙擴(kuò)散電泳后取出瓊脂板，向槽中加入預(yù)溫的瓊脂膠封底。用毛細(xì)滴管加入抗人

全血清，充滿槽內(nèi)，勿使外溢。將板平置濕盒內(nèi)，置37c溫箱擴(kuò)散24h后觀察結(jié)果。

【結(jié)果分析】

1.觀察已分離的血清抗原成分與相應(yīng)抗體形成的沉淀弧。根據(jù)正常人血清各蛋白成分

所處的電泳位置可分為白蛋白（Alb）區(qū)、球蛋白a區(qū)、P區(qū)和￥區(qū)。待鑒定的提純?nèi)薎gG

的沉淀弧應(yīng)主要在Y區(qū)，并可延伸到B區(qū)，甚至a區(qū)。如出現(xiàn)兩條以上沉淀線，則指示

提取物不純。

2.若抗原抗體反應(yīng)形成的沉淀線很弱，肉眼難見，可將瓊脂板用生理鹽水浸泡10h（其

間應(yīng)換液數(shù)次），以去除未反應(yīng)的蛋白。再將板浸入10?40g/L糅酸水溶液中，lOmin后取

出觀察，可增加沉淀線的清晰度。

3,如欲制作染色標(biāo)本，可將瓊脂板浸泡于生理鹽水中24?48h,其間換水2?3次，以除

去未反應(yīng)的蛋白，再用蒸儲水浸泡2h除鹽，然后于板上覆蓋用水浸濕的棉布一塊，置于37℃

溫箱過夜，使其干燥，再浸入氨基黑染液中染10?20min,用脫色液脫色，保存。

4.免疫電泳的主