KTB1252-CN-ATP檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測試劑盒（微量法）

ATP檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測試劑盒（微量法）原理ATP檸檬酸裂解酶（ATPcitratelyase，ACL）是催化檸檬酸生成乙酰輔酶A的關(guān)鍵胞質(zhì)酶，其催化產(chǎn)生的乙酰輔酶A是合成脂肪酸與膽固醇等脂類物質(zhì)的主要原料，并可參與相關(guān)重要蛋白的修飾作用，是體內(nèi)能源物質(zhì)代謝的樞紐性物質(zhì)。CheKine?ATP檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動(dòng)植物組織，細(xì)菌和細(xì)胞，血清（漿）。在該試劑盒中，在ATP和輔酶A存在的情況下，ACL能將檸檬酸催化裂解為乙酰輔酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸鹽，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。包裝清單試劑盒組分規(guī)格儲(chǔ)存條件48T96TExtractionBuffer60mL60×2mL4℃ReagentⅠ12mL24mL4℃ReagentIIPowder×1vialPowder×1vial-20℃，避光保存ReagentIIIPowder×1vialPowder×1vial4℃，避光保存注意：正式檢測前，建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。注意：ExtractionBuffer和ReagentI有少許刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Note:ExtractionBufferandReagentIhaveaslightirritatingodor,soitisrecommendedtoexperimentinafumehood.ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫。-20℃避光保存。ReagentIII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。WorkingReagent：臨用前配制；將ReagentII和ReagentIII轉(zhuǎn)移至ReagentⅠ中，充分溶解待用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。測定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細(xì)菌和細(xì)胞：收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)菌或細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞30次（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）：直接檢測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到340nm，可見光分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。將WorkingReagent在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）預(yù)熱5min。操作表（下述操作在96孔UV板或微量玻璃比色皿中操作）：試劑測定孔（μL）樣本20WorkingReagent180混勻，立即記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和320s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.02可適當(dāng)加大樣本量或延長反應(yīng)時(shí)間。如果ΔA大于0.4，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。ACL活性的計(jì)算：使用96孔UV板測定的計(jì)算公式如下按樣本蛋白濃度計(jì)算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活力單位。ACL(U/mgprot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=643.08×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：單位的定義：每克組織每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACL(U/g鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=643.08×ΔA÷W按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：單位的定義：每104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACL(U/104)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(n×V樣÷V樣總)÷T=643.08×ΔA÷n按液體體積計(jì)算單位的定義：每mL液體每分鐘消耗1nmolNADH定義為一個(gè)酶活性單位。ACL(U/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=643.08×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入ExtractionBuffer的體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；W：樣本質(zhì)量，g；n：細(xì)胞總數(shù)，以萬計(jì)。使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計(jì)算即可。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對樣品進(jìn)行檢測。Figure1.本試劑盒測定兔肝臟和煙草葉中ACL的活性相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1261CheKine?乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性檢測試劑