《光學(xué)顯微鏡圖像解析》課件

光學(xué)顯微鏡圖像解析歡迎來到本課程！課程簡介目標(biāo)掌握光學(xué)顯微鏡的基本原理和操作技巧內(nèi)容從光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造到圖像解析，涵蓋基礎(chǔ)知識(shí)和應(yīng)用實(shí)踐意義為生命科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究提供基礎(chǔ)知識(shí)和技術(shù)支持光學(xué)顯微鏡的發(fā)展歷程11590ZachariasJanssen發(fā)明了第一臺(tái)復(fù)合顯微鏡21665RobertHooke觀察到軟木塞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)31674AntonvanLeeuwenhoek觀察到細(xì)菌和紅血球419世紀(jì)顯微鏡技術(shù)快速發(fā)展，例如物鏡的改進(jìn)和光源的應(yīng)用520世紀(jì)電子顯微鏡問世，為人類觀察微觀世界打開了新的視野光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造鏡筒連接物鏡和目鏡的垂直管，用于固定和調(diào)節(jié)目鏡的位置載物臺(tái)放置載玻片的地方，可以移動(dòng)和固定載玻片物鏡轉(zhuǎn)換器可旋轉(zhuǎn)的圓盤，上面安裝著不同倍數(shù)的物鏡聚光器調(diào)節(jié)光源照射到樣品上的角度和強(qiáng)度光路系統(tǒng)的構(gòu)成光源提供照射樣品的光線，可以是自然光或人工光源聚光器集中光線并照射到樣品上物鏡將樣品放大并投影到目鏡目鏡再次放大物鏡的圖像并最終呈現(xiàn)給觀察者物鏡和物鏡的分類按放大倍數(shù)分類低倍物鏡（4x、10x）、高倍物鏡（40x、100x）按鏡片結(jié)構(gòu)分類消色差物鏡、復(fù)消色差物鏡、平場(chǎng)消色差物鏡按工作距離分類長工作距離物鏡、短工作距離物鏡光源和照明系統(tǒng)光源種類鹵素?zé)?、LED燈、激光燈照明方式透射照明、反射照明、暗場(chǎng)照明照明控制亮度調(diào)節(jié)、光斑大小調(diào)節(jié)成像系統(tǒng)和成像過程光源照射光源照射到樣品上1透射光線透射光線通過物鏡被放大2目鏡放大目鏡再次放大圖像3人眼觀察人眼觀察最終的圖像4放大倍數(shù)和分辨率100x放大倍數(shù)物鏡放大倍數(shù)乘以目鏡放大倍數(shù)0.2μm分辨率顯微鏡能夠分辨兩個(gè)相鄰點(diǎn)的最小距離成像缺陷及其校正1球面像差不同光線通過物鏡的不同位置聚焦在不同的點(diǎn)2色差不同顏色的光線通過物鏡聚焦在不同的點(diǎn)3像散不同方向的光線通過物鏡聚焦在不同的點(diǎn)光學(xué)顯微鏡的種類偏光顯微鏡用于觀察具有雙折射性質(zhì)的樣品相差顯微鏡用于觀察透明或無色樣品熒光顯微鏡用于觀察被熒光染料標(biāo)記的樣品共聚焦顯微鏡用于獲得高分辨率的三維圖像偏光顯微鏡原理利用偏振光照射樣品，觀察樣品的光學(xué)性質(zhì)應(yīng)用觀察晶體結(jié)構(gòu)、纖維結(jié)構(gòu)、生物組織等相差顯微鏡原理利用光波的相位差來增強(qiáng)圖像對(duì)比度應(yīng)用觀察透明或無色樣品，例如活細(xì)胞、細(xì)菌等熒光顯微鏡原理利用熒光染料標(biāo)記樣品，觀察樣品的熒光信號(hào)應(yīng)用觀察特定蛋白質(zhì)、DNA、RNA等分子共聚焦顯微鏡原理利用激光掃描樣品，獲得高分辨率的三維圖像應(yīng)用觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、生物組織的三維形態(tài)等電子顯微鏡簡介原理利用電子束照射樣品，獲得樣品的電子圖像特點(diǎn)分辨率更高，可觀察更小的結(jié)構(gòu)樣品制備的基本步驟固定保持樣品形態(tài)和結(jié)構(gòu)脫水去除樣品中的水分包埋將樣品包埋在樹脂中切片切出薄片染色增強(qiáng)樣品對(duì)比度樣品制備方法1切片技術(shù)將樣品切成薄片，以便于觀察2染色技術(shù)用染料使樣品不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色3免疫熒光技術(shù)利用抗體標(biāo)記特定蛋白，觀察其在細(xì)胞中的分布切片技術(shù)石蠟切片用于觀察組織的整體結(jié)構(gòu)冰凍切片用于觀察細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)染色技術(shù)蘇木精-伊紅染色使細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成紅色吉姆薩染色使細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成紅色免疫熒光染色利用熒光抗體標(biāo)記特定蛋白脫水和包埋1脫水使用一系列梯度酒精溶液去除樣品中的水分2包埋將脫水的樣品浸入樹脂中，使樣品硬化切片機(jī)的使用操作步驟將包埋好的樣品固定在切片機(jī)上，調(diào)節(jié)切片厚度注意事項(xiàng)切片要平整，避免切片破損顯微鏡操作技巧1對(duì)光調(diào)節(jié)光源和聚光器，使視野明亮2調(diào)焦先用低倍鏡觀察，再逐漸換用高倍鏡3觀察調(diào)整目鏡和載物臺(tái)，使圖像清晰成像質(zhì)量的影響因素1光學(xué)調(diào)節(jié)物鏡、目鏡、聚光器等光學(xué)元件的調(diào)節(jié)2樣品制備固定、脫水、包埋、切片、染色等樣品制備步驟3環(huán)境因素溫度、濕度、振動(dòng)等環(huán)境因素光學(xué)調(diào)節(jié)1物鏡選擇根據(jù)觀察目標(biāo)選擇合適的物鏡2聚光器調(diào)節(jié)調(diào)整光源照射到樣品上的角度和強(qiáng)度3目鏡調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)目鏡的位置，使圖像清晰場(chǎng)深和焦深控制場(chǎng)深在物鏡聚焦的情況下，樣品上能同時(shí)保持清晰的范圍焦深在目鏡聚焦的情況下，樣品上能同時(shí)保持清晰的范圍相差調(diào)節(jié)原理通過改變光線通過不同區(qū)域時(shí)的相位，增強(qiáng)圖像對(duì)比度方法調(diào)整相差環(huán)和相差板的位置偏振光的調(diào)節(jié)原理利用偏振光照射樣品，觀察樣品的光學(xué)性質(zhì)方法調(diào)整偏光鏡和檢偏鏡的位置熒光染料的選擇選擇原則根據(jù)樣品性質(zhì)和觀察目標(biāo)選擇合適的染料常見染料DAPI、FITC、TRITC等顯微鏡圖像采集1圖像分辨率像素?cái)?shù)量決定圖像的清晰度2曝光時(shí)間控制光線照射樣品的時(shí)間3圖像格式常見格式包括TIFF、JPG、PNG等數(shù)字成像設(shè)備1CCD相機(jī)傳統(tǒng)的數(shù)字成像設(shè)備，性能穩(wěn)定2CMOS相機(jī)新型數(shù)字成像設(shè)備，速度更快，靈敏度更高成像參數(shù)設(shè)置1曝光時(shí)間控制光線照射樣品的時(shí)間，影響圖像的亮度2增益放大信號(hào)強(qiáng)度，影響圖像的對(duì)比度3白平衡調(diào)節(jié)圖像的顏色平衡，使圖像自然圖像分辨率和存儲(chǔ)格式分辨率像素?cái)?shù)量決定圖像的清晰度，越高越清晰存儲(chǔ)格式TIFF格式能夠保存更多圖像信息，適合科學(xué)研究圖像分析軟件1ImageJ免費(fèi)開源的圖像分析軟件，功能強(qiáng)大2AdobePhotoshop常用的圖像處理軟件，功能豐富3MetaMorph專業(yè)的圖像分析軟件，支持多種分析功能圖像處理基礎(chǔ)1亮度和對(duì)比度調(diào)整增強(qiáng)圖像的細(xì)節(jié)2色彩平衡調(diào)整圖像的顏色平衡，使圖像自然3銳化提高圖像的清晰度圖像增強(qiáng)技術(shù)1閾值分割將圖像分割成不同的區(qū)域2邊緣檢測(cè)檢測(cè)圖像的邊緣信息3噪聲去除去除圖像中的噪聲圖像測(cè)量與定量分析1長度、面積測(cè)量測(cè)量圖像中目標(biāo)物的尺寸2亮度、顏色分析分析圖像中目標(biāo)物的亮度和顏色3統(tǒng)計(jì)分析對(duì)圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析三維成像技術(shù)原理通過對(duì)樣品進(jìn)行多角度掃描，重建三維圖像應(yīng)用觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、生物組織的三維形態(tài)多通道成像原理使用多種熒光染料標(biāo)記不同的目標(biāo)，同時(shí)采集不同通道的圖像應(yīng)用觀察多種目標(biāo)在細(xì)胞或組織中的分布和相互作用實(shí)例分析與討論1細(xì)胞圖像分