番茄抗晚疫病基因Ph-2的精細(xì)定位及克隆進(jìn)展

番茄抗晚疫病基因Ph-2的精細(xì)定位及克隆進(jìn)展

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所加工番茄課題組鄭崢2014年7月29日，廣西，桂林中國(guó)園藝學(xué)會(huì)番茄分會(huì)2014年會(huì)報(bào)告內(nèi)容研究背景研究?jī)?nèi)容研究結(jié)果結(jié)論未來(lái)研究計(jì)劃研究背景-番茄晚疫病晚疫?。↙ateBlight）由卵菌綱致病疫霉【Phytophthorainfestans(Mont.)deBary】引起，主要危害全球番茄和馬鈴薯的生產(chǎn)我國(guó)已報(bào)道的番茄晚疫病生理小種有8個(gè)，主要分布在我國(guó)番茄主產(chǎn)區(qū)（楊宇紅等，2004；劉雙平等，2009）

利用含有不同抗病基因的鑒別寄主，對(duì)8個(gè)晚疫病病菌進(jìn)行生理小種鑒定，T1（1-5號(hào)）、T1.2（6號(hào)）、T0（7號(hào)）和T1.4（8號(hào)）鑒別寄主

病原菌純化物編號(hào)/Numberofpurifiedisolate12345678Moneymaker（Ph-0）SSSSSSSSTs33（Ph-1）SSSSSSRSW.Va700（Ph-2）RRRR

RSRRL3708（Ph-3）RRRRRRRRLA1033（Ph-4）RRRRRRRS研究背景-我國(guó)番茄晚疫病生理小種研究背景-番茄晚疫病抗性數(shù)量抗性（QTL）：來(lái)自S.habrochaites、S.pennellii（Brouweretal.,2004；Foolad，2012）質(zhì)量抗性（R）：來(lái)自S.pimpinellifolium的Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4、Ph-5基因Gene

Chrom.Ref.Ph-17Peirce,1971Ph-210Moreauetal.,1998Ph-39Chunwongseetal.,2002Ph-42Kole,2008

Ph-51；10Fooladetal.,2009

最近，項(xiàng)目組通過(guò)對(duì)全球性（分別來(lái)自TGRC和AVRDC）收集的441份S.pimpinellifolium材料鑒定，尚未發(fā)現(xiàn)新抗源研究背景-番茄晚疫病抗性QTL抗性微效且有連鎖累贅Ph-1基因已被多個(gè)新的生理小種克服目前關(guān)于Ph-4基因的公開(kāi)報(bào)道比較少已證明Ph-5基因是由兩個(gè)位點(diǎn)控制，且抗性不如Ph-2與Ph-3的疊加后抗性Ph-2、Ph-3基因?qū)ξ覈?guó)的主流晚疫病生理小種具有較好的抗性Merketal.2012.研究背景-番茄晚疫病抗性Ph-3

基因已被我所克隆，并證明其具有典型的CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu)（Zhangetal.,2014）研究背景-番茄晚疫病抗性-Ph-3

Hawaii7996×WVa700醋栗番茄WVa700中的抗晚疫病基因Ph-2

屬不完全顯性，被定位在CP105與TG233之間，遺傳距離為8cM（Moreauetal.，1998）研究背景-番茄晚疫病抗性-Ph-2對(duì)Ph-2基因進(jìn)行精細(xì)定位及

克隆，深入研究其抗性機(jī)制，為抗病育種及闡明番茄與晚疫病病菌的互作提供理論依據(jù)利用克隆出的番茄抗晚疫病基因Ph-2及Ph-3結(jié)合對(duì)應(yīng)晚疫菌生理小種研究番茄與晚疫病菌互作機(jī)制研究目的接種晚疫病病菌蛋白組測(cè)序分析蛋白表達(dá)差異分析Ph-2基因抗性機(jī)制構(gòu)建抗感池抗病WVa700與感病M82重測(cè)序數(shù)據(jù)提取DNALA3152×M82F1生理小種鑒定F2分離群體區(qū)域內(nèi)候選基因分析開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記對(duì)Ph-2基因進(jìn)行精細(xì)定位研究?jī)?nèi)容-技術(shù)路線生理小種測(cè)序分析互作機(jī)制根據(jù)番茄抗感病材料WVa700與M82重測(cè)序（5X）獲得的數(shù)據(jù)選定CP105和TG233兩個(gè)標(biāo)記之間8cM的候選區(qū)域在候選區(qū)域內(nèi)共開(kāi)發(fā)

6個(gè)Indel、26個(gè)

SNP和1個(gè)CAPS多態(tài)性標(biāo)記將Ph-2基因定位于Indel-4和CAPS-1之間，兩標(biāo)記的遺傳距離為2.0cM，物理距離為227Kb結(jié)果與分析-

Ph-2的精細(xì)定位結(jié)果與分析-Ph-2基因候選基因的預(yù)測(cè)利用HMM模型

掃描目標(biāo)區(qū)域，共發(fā)現(xiàn)了32個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框?qū)蜻x基因進(jìn)行R基因功能結(jié)構(gòu)域比對(duì)，發(fā)現(xiàn)6個(gè)ORF含有

R基因類型功能域結(jié)合

SGN（http://sol）網(wǎng)站上的注釋進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)基因具有完整的CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu)，命名為SL-Ph-2-RGA1利用醋栗番茄測(cè)序（ColdSpringHarborLaboratory）及重測(cè)序（我所）結(jié)果對(duì)候選基因區(qū)域進(jìn)行了比對(duì)正在進(jìn)行：GenomewalkingHomologybasedcloning+Map-basedcloningVIGS結(jié)果與分析-Ph-2基因候選基因的獲得結(jié)果與分析-Ph-2基因候選基因（馬鈴薯）將目標(biāo)區(qū)域所對(duì)應(yīng)的馬鈴薯基因組序列進(jìn)行R基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)了16個(gè)候選R基因其中一個(gè)與SL-Ph-2-RGA1基因的相似度為82.4%，染色體共線性分析后，推測(cè)為馬鈴薯抗晚疫病基因

Rpi-berRpi-berBSA10株F2抗、感材料，在接種前后混樣建池進(jìn)行非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學(xué)分析A抗病材料接種前B感病材料接種前C抗病材料接種后D感病材料接種后ACDBPh-2調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)（乙烯、水楊酸、茉莉酸、赤霉素、細(xì)胞分裂原活化蛋白信號(hào)的蛋白質(zhì)）受晚疫菌調(diào)控的植物基礎(chǔ)抗性抑制或易感蛋白相關(guān)病原菌效應(yīng)因子（effector）掃描？？抗病蛋白？？通過(guò)對(duì)4組處理葉片分析表明，在4個(gè)組均檢測(cè)到的蛋白共有105種，包括能量相關(guān)、光合作用、物質(zhì)代謝、蛋白合成、防御與抗脅迫、細(xì)胞壁合成以及未知的蛋白抗池和感池材料接種晚疫病病菌前后，蛋白質(zhì)含量和種類都發(fā)生明顯變化

結(jié)果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學(xué)分析

AB抗病材料接種后，97種蛋白含量增加（圖A），8種蛋白含量降低和兩種蛋白含量基本沒(méi)有明顯變化（圖B）

抗病材料接種前后蛋白組變化結(jié)果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學(xué)分析

感病材料接種前后蛋白組變化感病材料接種晚疫病病菌后，17種蛋白含量增加（圖A），54種蛋白含量降低和34種蛋白含量基本沒(méi)有明顯變化（圖B）AB結(jié)果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學(xué)分析四組材料中，只有抗池材料在接種前（A組）和接種后（C組）發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)胞外鈣受體，且C組是A組的5.8倍抗病材料接種后，C組中延伸因子含量是A組的3.6倍，而且抗病材料接種后延伸因子（EF-2）含量明顯高于感病材料，C組是D組的29.6倍。延伸因子（EF-2）與Ca2+發(fā)生耦合，參與植物抗性信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。因此，鈣信號(hào)傳導(dǎo)通路可能參與了Ph-2基因介導(dǎo)的番茄晚疫病抗性PR-5蛋白是水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因（Limetal.,2013），抗病材料接種后，PR-5蛋白的含量增加，水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與

Ph-2基因介導(dǎo)的抗性，這與水楊酸介導(dǎo)Ph-3基因抗性結(jié)論一致結(jié)果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學(xué)分析抗病相關(guān)蛋白含量變化結(jié)果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學(xué)分析精細(xì)定位Ph-2至2cM區(qū)域，并將側(cè)翼標(biāo)記轉(zhuǎn)換為簡(jiǎn)單的Indel和CAPS標(biāo)記通過(guò)生物信息及VIGS