免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

免疫組織化學(xué)染色技術(shù)李會(huì)強(qiáng)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院Email:lihuiqiang1965@163.com組織化學(xué)染色技術(shù)HistochemistryTechnique

觀察對(duì)象組織、細(xì)胞使用工具普通顯微鏡熒光顯微鏡形態(tài)與結(jié)構(gòu)蘇木素曙紅免疫組織化學(xué)染色技術(shù)

ImmunohistochemistryTechnique指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原（目的蛋白）進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)免疫檢測(cè)方法。ImmunohistochemistryTechnique特定蛋白（抗原）（透膜）（一抗）（二抗）（封片）授課提綱基質(zhì)標(biāo)本的制作熒光免疫組化技術(shù)酶免疫組化技術(shù)相關(guān)問題與解決方案授課提綱

基質(zhì)標(biāo)本的制作熒光免疫組化技術(shù)酶免疫組化技術(shù)相關(guān)問題與解決方案標(biāo)本類型

組織標(biāo)本冰凍切片石蠟切片（脫蠟和水化）細(xì)胞標(biāo)本體外培養(yǎng)細(xì)胞（單層細(xì)胞、懸浮細(xì)胞）體液細(xì)胞（涂片）固定與保存固定的目的防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞形態(tài)與機(jī)構(gòu)；保存組織細(xì)胞抗原性；防止標(biāo)本脫落；防止滋生微生物，預(yù)防組織腐敗標(biāo)本固定以不損傷細(xì)胞形態(tài)、不損傷抗原特異性為基本原則固定與保存固定劑

蛋白類乙醇或甲醇

微生物類丙酮、三氯化碳多糖類10%福爾馬林固定與保存常用固定劑中性甲醛（10%）多聚甲醛（4%）

如原位雜交需含內(nèi)源性RNA酶抑制劑（DEPC）細(xì)胞通透(permeabilisation)目的：

促使抗體充分進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合方法：

TritonX-100(0.1%-1%)（40毫升PBS+120微升TritonX-100）

蛋白酶K抗原修復(fù)目的：充分暴露抗原表位，利于抗體識(shí)別。方法：

酶消化修復(fù)（無花果蛋白酶，胰蛋白酶）消化法；熱修復(fù)（加熱打開組織抗原因固定所致抗原表位交聯(lián)）微波處理煮沸處理

高壓處理抗原修復(fù)修復(fù)緩沖液檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)Tris-Hcl(pH7.0～8.0)EDTA(pH8.0)

授課提綱基質(zhì)標(biāo)本的制作

熒光免疫組化技術(shù)酶免疫組化技術(shù)相關(guān)問題與解決方案標(biāo)記物熒光素異硫氰酸熒光素（FITC）四乙基羅丹明（RB200）藻紅蛋白（PE）藻紅蛋白花青苷（PE-Cy5）熒光素異硫氰酸熒光素（FITC）520-530nm490-495nm黃綠色熒光熒光素四乙基羅丹明（RB200）540nm625nm橘紅色熒光熒光素藻紅蛋白（PE）488-561nm578nm熒光素別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin,APC

）650nm660nm2223熒光素-抗體標(biāo)記FITC-IgG（蛋白）技術(shù)類型直接染色法熒光素直接標(biāo)記在特異性抗體（Ab1)間接染色法熒光素標(biāo)記第二抗體（Ab2)第二抗體針對(duì)第一抗體種屬特異性的表位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）直接法

優(yōu)點(diǎn)

簡(jiǎn)單

特異實(shí)例：細(xì)胞鑒定免疫細(xì)胞及其亞群（流式細(xì)胞術(shù)）

T細(xì)胞

CD3+CD4+CD8+

B細(xì)胞

NK細(xì)胞免疫細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)28SuppressorTcellR1Tcell/BcellHelperTcell間接法

優(yōu)點(diǎn)：抗原抗體實(shí)例：檢測(cè)抗核抗體檢測(cè)原理已知抗原肝細(xì)胞/HEp-2待檢抗體第二抗體熒光標(biāo)記兔抗人Ig實(shí)例：檢測(cè)病原體（病毒、細(xì)菌）檢測(cè)原理待檢病毒（抗原）已知抗體單抗或多抗第二抗體熒光標(biāo)記羊抗鼠（或兔）Ig熒光顯微鏡（落射式）關(guān)鍵汞燈光源激發(fā)濾片暗場(chǎng)聚光鏡吸收濾片熒光顯微鏡（落射式）熒光顯微鏡（落射式）授課提綱基質(zhì)標(biāo)本的制作熒光免疫組化技術(shù)

酶免疫組化技術(shù)相關(guān)問題與解決方案主要類型酶標(biāo)記抗體同熒光免疫組化非酶標(biāo)記抗體酶-抗酶系統(tǒng)生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)技術(shù)特點(diǎn)以酶作為抗原，制備抗酶抗體；酶（抗原）與抗酶（抗體）結(jié)合制備酶-抗酶復(fù)合物；通過橋聯(lián)抗體與識(shí)別系統(tǒng)（待檢抗原-特異性抗體）連接；酶橋法常用酶和相應(yīng)底物過氧化物酶Peroxidase（P）二氨基聯(lián)苯胺（DAB）堿性磷酸酶（AP）alkalinephosphatase（AP）溴氯羥吲哚磷酸鹽（BCIP）

過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法PAPPAP復(fù)合物抗體選擇第一抗體識(shí)別抗原第二抗體（橋聯(lián)抗體）能同時(shí)與第一、第三抗體結(jié)合第三抗體抗酶抗體與第一抗體同源PPPAAA

κλ圖

雙酶雙底物(復(fù)合物法)雙重酶標(biāo)染色原理兔PAPGARIgG兔抗κAg鼠APAAPGAM.IgG鼠抗λ實(shí)例：淋巴瘤輕鏈雙重染色法一抗兔抗κ鼠抗λ二抗羊抗兔羊抗鼠顯色系統(tǒng)

PAPAPAAP親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體（ABC）生物素（Biotin）親和素（Avidin）生物素標(biāo)記抗體（B-Ab）生物素標(biāo)記過氧化物酶（B-P）親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體（ABC）EnVision授課提綱基質(zhì)標(biāo)本的制作熒光免疫組化技術(shù)酶免疫組化技術(shù)

相關(guān)問題與解決方案識(shí)別抗體（第一）選擇單克隆抗體（McAb）特異性強(qiáng)敏感性差多克隆抗體（McAb）特異性差敏感性強(qiáng)識(shí)別（第一）抗體選擇構(gòu)象糖基化碳水化合物第二抗體選擇選擇顯色系統(tǒng)熒光免疫組化酶免疫組化PAPAPAAPABCLAB？封閉非特異性結(jié)合預(yù)先溫浴特異性顯色具備特定部位顯色特定組織、特定細(xì)胞、特定結(jié)構(gòu)不均一顯色非特異性顯色主要原因內(nèi)源性酶內(nèi)源性生物素抗體特異性不強(qiáng)漂洗不充分基質(zhì)制作